以上市药物为物质基础的抗丝状病毒和抗尼帕病毒的药物发现

摘要

丝状病毒(fi loviruses)和尼帕病毒(Nipah Virus，NiV)均属于危害人类健康和公共安全的高致病病毒。病毒感染人后会导致出血热和严重脑炎，其特点为发病快，致死率高，且现尚无药物或疫苗。研发针对上述两类病毒治疗药物不但可以援助非洲和东南亚疫情多发地区，而且对我国也是必要的药物储备。
　　丝状病毒包括埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)和马尔堡病毒(Marburg virus，MARV)，可分别引起埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever，EHF)和马尔堡出血热(Marburg hemorrhagic fever，MHF)，其中EHF致命性更强。NiV引起的严重病毒性脑炎和呼吸系统疾病致死率也比较高。由于两类病毒的高危险性，其活病毒实验需要生物安全级别4级(Biosafety Level4，BSL-4)实验条件，严格的实验条件限制了其抗病毒药效学评价。
　　丝状病毒和尼帕病毒属于囊膜病毒，其囊膜源于宿主细胞膜，其主要成分是脂质和蛋白。囊膜糖蛋白参与病毒侵入宿主细胞过程:首先囊膜糖蛋白识别宿主细胞表面受体并与之结合，之后囊膜与宿主细胞融合，进而引发病毒后续感染过程。丝状病毒表面包膜糖蛋白(glycoprotein，GP)是介导其侵入的唯一糖蛋白;NiV介导该过程的蛋白有两个:G和F蛋白。病毒进入细胞是病毒入侵的第一步，因此阻断该过程可有效抑制病毒感染。
　　药物重定位在抗感染药物研发中的应用被广泛认可，由于已上市药物安全性和不良反应均已明确，且生产工艺成熟，因此以其为物质基础有可能实现在较短时间内找到可用于临床的抗丝状病毒药物和抗尼帕病毒药物。假病毒技术是用于研究高危病毒的经典方法。本论文应用该技术，制备了以丝状病毒表面糖蛋白(Glycoprotein，GP)为外壳蛋白包裹HIV-1-luc核心的假病毒，包括扎伊尔型埃博拉病毒（ZEBOV-GP/HIV-1-luc）、苏丹型埃博拉病毒（SEBOV-GP/HIV-1-luc）和马尔堡病毒（MARV-GP/HIV-1-luc），以及以尼帕病毒表面糖蛋白F(Nipah virus glycoproteinF，NiV-F)和G(Nipah virus glycoprotein G，NiV-G)为外壳蛋白包裹HIV-1-luc核心的假病毒(NiV-F-G/HIV-1-luc)。然后应用上述假病毒在BSL-2实验室对已上市药物库进行评价，旨在发现丝状病毒进入抑制剂和尼帕病毒进入抑制剂。
　　本论文首先应用ZEBOV-GP/HIV-1-luc模型筛选了840个已上市药物，结果显示，有12个性激素类药物可抑制ZEBOV-GP/HIV-1-luc感染，其中IC50＜1μmol·L-1的药物有3个，分别是枸橼酸托瑞米芬(IC50:0.19±0.02μrmol·L-1)、枸橼酸他莫昔芬(IC50:0.32±0.01umol·L-1)和枸橼酸克罗米芬(IC50:0.53±0.02μmol·L-1)。IC50介于1μmol·L-1～10μmol·L-1的药物有7个，分别是雌二醇苯甲酸酯(IC50:1.83±5.69μmol·L-1)、盐酸雷洛昔芬(IC50:3.48±0.07μmol·L-1)、马烯雌酮(IC50:4.00±9.94μmol·L-1)、雌二醇(IC50:5.26±9.92μmol·L-1)、炔雌醚(IC50:6.36±5.37μmol·L-1)、雌激素酮(IC50:6.87±0.03μmol·L-1)及非那雄胺(IC50:9.94±0.45μmol·L-1)。此外，己烷雌酚(IC50:14.20±0.55μmol·L-1)和醋酸氯地孕酮(IC50:24.60±0.36μmol·L-1)也有弱活性。进一步应用SEBOV-GP/HIV-1-luc和MARV-GP/HIV-1-luc评价上述药物对其抑制活性，结果显示，枸橼酸托瑞米芬、枸橼酸他莫昔芬、枸橼酸克罗米芬、盐酸雷洛昔芬以及炔雌醚对丝状病毒SEBOV-GP/HIV-1-luc和MARV-GP/HIV-1-luc也有抑制作用。
　　本论文还评价了1300个已上市药物抗尼帕病毒活性。应用NiV-F-G/HIV-1-luc感染高表达ephrin-B2(EFNB2)的293T细胞，并在感染前加入受试药物，通过检测被感染细胞中报告基因表达水平评价病毒的感染程度。结果显示，1300个已上市药物中无尼帕病毒进入抑制剂。
　　综上所述，本论文在BSL-2实验室条件下应用假病毒技术通过制备丝状病毒和尼帕病毒，在细胞水平分别评价了840个和1300个已上市药物抗丝状病毒和抗尼帕病毒活性，结果发现了5个性激素类药物对丝状病毒具有广谱抑制活性，而1300个已上市药物中无尼帕病毒进入抑制剂。本研究结果为临床选择潜在抗丝状病毒药物提供了可供参考的实验数据。

目录

摘要

前言

实验材料

实验方法

实验结果

第一部分 以上市药物为物质基础的抗丝状病毒药物发现

1 丝状病毒最佳稀释度的确定

2 SEBOV-GP／HIV-1模型的优化及结果

3 12个性激素类药物可抑制ZEBOV糖蛋白介导的病毒进入

4 5个性激素类药物对丝状病毒进入有广谱抑制作用

讨论一

结论一

第二部分 以上市药物为物质基础的抗尼帕病毒药物的发现

1 293T-ephrin-B2-EGFP细胞

2 尼帕病毒最佳稀释度的确定

3 应用NiV-F-G／HIV-1-luc模型对1300个己上市药物进行药效学评价

讨论二

结论二

总结

参考文献

缩写对照表

致谢

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