苯甲酸对人参的自毒作用及人参差异基因表达分析

摘要

人参(Panax ginseng C.A.Meyer.)为五加科人参属药用植物，是我国传统名贵中药材。人参忌地性极强，重茬参地几十年内无法重复栽参。人参连作障碍问题严重制约了人参产业的可持续发展。自毒作用是造成人参连作障碍的主要因素之一。在自毒胁迫下，人参基因表达调控系统如何变化以应对外界胁迫，至今尚无研究报道。本研究旨在借助高通量测序平台从转录组水平研究苯甲酸自毒胁迫作用下人参功能基因的差异表达情况，明确差异表达基因所在的信号通路及其表达调控模式，根据注释信息找到与自毒胁迫相关的功能基因。从而揭示人参响应自毒胁迫的分子应答机制，为解决人参连作障碍提供理论基础。具体结果如下:
　　1.以7种从老参地分离并鉴定的酚酸类化感自毒物质为例，研究了其对人参种子生长及人参根尖显微形态的影响。初步确定了这些酚酸类化感物质在特定浓度下对人参种子胚根和胚轴的生长均具有化感效应。
　　2.根据酚酸类化感物质对人参种子自毒活性研究实验结果，以苯甲酸为例研究了其对人参根尖显微结构和超微结构的影响。同时研究了苯甲酸在田间对人参幼苗生长的影响。综合以上结果明确了苯甲酸对人参化感自毒作用的有效临界浓度为25mg·L-1左右。
　　3.以25 mg·kg-1苯甲酸处理正常生长的人参幼苗，分别于处理后第0、1、3、5、7、9d采集人参根、茎、叶样品，Trizol法提取18份样品的RNA，利用RNA-Seq测序技术对上述样品进行转录组测序，共获得了996，000，000条100 nt读长的片段，利用Trinity将转录组数据组装后共获得72732个Contigs，平均GC含量(GC％)为38.55％，组装序列的N50长度和平均读长分别为1794 bp和1428 bp。以0d为对照，分别获得3，697、2，828个上调和下调的差异表达基因。对测序组装的序列进行功能注释，分别有11，838、15，469、21，807个基因在UniProt数据库、NR数据库、NT数据库中得到注释。在KEGG数据库中，共有2，783个基因在262个途径中得到了识别。对组装数据进行GO功能聚类分析的结果表明，上调表达的基因主要富集在‘Enzyme inhibitor activity’，‘Carboxylesterase activity’，‘Pectinesterase activity’，‘Centrosome cycle and duplication’和‘Mitotic spindle elongation’;下调表达的基因主要富集在‘Cell wall organization or biogenesis’，‘Ion binding’，‘Stress response’和‘Secondary metabolic process’。
　　4.研究了苯甲酸对人参脯氨酸、丙二醛、根系活力生理指标的影响。结合转录组测序结果，共得到10个与上述生理指标相关的差异表达基因，包括:2个脯氨酸相关基因P5CS，1个丙二醛相关基因APX，7个活性氧相关基因。
　　5.研究了苯甲酸胁迫下人参皂苷合成途径相关基因的差异表达情况，共获得7个差异表达基因。分别是2个FPS基因、2个GPS基因、1个HMGS基因和2个UGT基因。
　　6.研究了苯甲酸胁迫下人参转录因子相关基因的差异表达情况，共获得15个差异表达基因，分别是2个AP2/ERF基因、4个MYB基因和9个WRKY基因。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献综述

1 植物化感作用

1．1 化感物质的种类

1．2 化感物质的合成途径

1．3 化感物质的作用方式

1．4 化感物质的作用机制

2 自毒作用与植物连作障碍的关系

3 人参连作障碍

3．1 人参连作障碍产生的原因

4 转录组学的研究方法及应用

5 转录组学在植物自毒胁迫研究中的应用

6 人参转录组学研究概述

7 小结

第二章 酚酸类物质对人参种子的化感作用研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 数据分析

2 结果与分析

2．1 酚酸类物质对人参种子胚根生长的影响

2．2 酚酸类物质对人参种子胚轴生长的影响

2．3 酚酸类物质对人参种子生长的化感综合效应

3 本章小结

第三章 苯甲酸对人参根尖组织结构及幼苗生长的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 苯甲酸对人参种子胚根根尖形态的影响

2．2 苯甲酸对人参根尖组织显微结构的影响

2．3 苯甲酸对人参根尖细胞超微结构的影响

2．4 苯甲酸对人参幼苗生长的影响

3 本章小结

第四章 苯甲酸胁迫下人参的转录组测序及基因的差异表达分析

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 工作液的配制和人参幼苗的培养

1．3 胁迫处理

1．4 RNA的提取

1．5 RNA-Seq文库的构建

1．6 数据组装

1．7 功能注释

1．8 表达量注释分析

1．9 qRT-PCR验证

2 结果与分析

2．1 RNA提取结果

2．2 Illumina测序数据统计

2．3 数据组装结果

2．4 基因功能注释

2．5 基因差异表达分析

2．6 GO功能富集分析

2．7 qRT-PCR验证

3 本章小结

第五章 苯甲酸对人参生理指标的影响及相关基因的差异表达分析

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 生理指标的测定

1．3 基因差异表达分析与qRT-PCR验证

2 结果与分析

3 本章小结

第六章 苯甲酸胁迫下人参皂苷合成途径相关基因的差异表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 本章小结

第七章 苯甲酸胁迫下人参转录因子相关基因的差异表达分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 本章小结

总结

参考文献

作者简介

攻读硕士期间发表论文情况

致谢

附录