CA16感染恒河猴模型以及相关病原和免疫学特性研究

摘要

Coxsackievirus A16(CA16)做为人类手足口病(HFMD)的重要病原体之一，以其不断在亚洲-太平洋地区的儿童群体中所引起的HFMD大规模流行已经成为一个重要的公众关注对象。尽管CA16感染所导致的HFMD较为温和，但已有的流行病学报道证明，CA16仍然可能在感染人群中引起少数的重症病例，以及可能引起重复感染，因此，深入对该病原的相关研究，已经成为一个重要的公共卫生问题。本论文的研究工作主要针对CA16在恒河猴感染模型中的病理学特征及免疫学反应表现，以及相关的CA16灭活疫苗技术原理等做了初步的探索，所得到的结果为该病毒的感染机理分析及疫苗的研究提供了初步的资料。
　　本课题的研究工作主要分为三个部分，首先，在前期建立EV71感染恒河猴婴猴模型研究的基础上，在恒河猴成年猴（4～5岁）幼猴（8～月10龄）和婴猴（1～3月龄）个体内建立了CA16感染动物模型，并观察到该病毒可通过鼻腔粘膜引起恒河猴幼猴和婴猴出现与人类手足口病相似的口腔粘膜疱疹、手足部疱疹以及发热等临床症状，还可出现典型的病毒血症和各组织器官病毒载量的轻微上升，其中以淋巴器官和CNS中病毒载量的上升最为明显，同时，可见到外周血中一过性IL-6和TNF-α的升高，这与笔者在建立EV71恒河猴婴猴模型时所表现出来的症状极其相似。另外，动物器官的组织病理观察表明，CA16的感染仅导致恒河猴出现肺脏、淋巴结等器官较轻的病理学改变，同时在皮肤疱疹病理组织中观察到部分嗜酸性细胞的出现。根据CA16在临床观察中可能出现反复感染的报道，对已感染的恒河猴婴猴、幼猴进行了第二、三次的重复感染试验，在此过程中，上述感染过程的表现均再次出现在相同动物的身上，但这些感染均不能明显诱导机体产生中和抗体反应，这似乎提示CA16病毒感染恒河猴、即使在重复感染的情况下，也未能诱导高滴度的中和抗体反应。
　　其次，笔者的工作探讨了以0、28天两剂免疫程序的实验性CA16灭活病毒疫苗免疫恒河猴后的免疫反应特征，实验结果表明，CA16灭活疫苗免疫恒河猴后可刺激其机体产生特异性细胞免疫反应，并且亦表现了相应的血清中和抗体上升，但在系统分析其病毒攻击后的免疫保护性和安全性的研究结果并不理想，免疫动物在受到病毒攻击后，85％的实验动物均出现了典型的疱疹、病毒血症以及相关临床症状，病毒攻击并未刺激机体血清中和抗体的四倍上升。
　　在第三部分工作中，进一步观察表明，CA16可以直接感染DC细胞，并在其中增殖的过程中，刺激细胞上调包括IL6、IL5等细胞因子的表达。同时感染的DC细胞与T细胞孵育后，再次回输T细胞至供体猴体内后，仍可观察到猴体出现典型的口腔及手足口部疱疹。这一结果提示CA16感染所引起的粘膜及皮肤疱疹病变，很有可能是免疫反应的相关病理性反应。另外，对前期人群临床实验中CA16感染阳性的血清样品中细胞因子、趋化因子和中和抗体的分析进一步提示了CA16感染人体后血清中部分细胞因子及趋化因子的特征性变化。
　　尽管本研究尚未能对CA16感染恒河猴及其免疫病理机制有全面的认识，但通过不同层次的分析所获得的一系列研究资料，将为CA16在非人灵长类的感染及免疫保护应用的研究提供相应的理论依据，也为CA16疫苗的研发提供了参考资料。

目录

摘要

前言

第一部分 CA16感染恒河猴不同年龄段模型的建立

1．材料和方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果与分析

2．1 不同年龄阶段恒河猴感染CA16后临床症状观察

2．2 不同年龄阶段恒河猴感染CA16后病毒血症及排毒情况

2．3 不同年龄阶段恒河猴感染CA16后主要组织器官病理及病毒载量变化情况

2．4 不同年龄阶段情淘舞}感染CA16后细胞因子变化

2．5 不同年龄阶段恒河猴感染CA16后中和抗体变化

3．讨论

第二部分 CA16实验性疫苗在恒河猴幼猴及婴猴模型中的保护性研究

1．实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果与分析

2．1 CA16灭活疫苗在恒河猴体内诱导的中和抗体动力学分析及相关免疫学分析

2．2 CA16灭活疫苗免疫恒河猴攻毒后临床表现

2．3 CA16灭活疫苗免疫恒河猴攻毒后病毒血症及排毒情况

2．4 CA16灭活疫苗免疫恒河猴攻毒后中和抗体变化

2．5 CA16灭活疫苗免疫恒河猴攻毒后诱导IFN-γ和IL4特异性细胞免疫反应分析

2．6 CA16灭活疫苗免疫恒河猴攻毒后诱导细胞因子变化

2．7 CA16灭活疫苗免疫恒河猴攻毒后病理变化、免疫组织化学及组织病毒载量变化

3．讨论

第三部分 CA16感染相关免疫细胞和细胞因子变化研究

1．实验材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果与分析

2．1 CA16感染外周血中淋巴细胞分析

2．2 CA16感染恒河猴CD11c+树突状细胞研究

2．3 体外培养恒河猴DC细胞研究

2．4 回输实验引起恒河猴体内免疫反应的观察

2．5 CA16感染病人血清中相关免疫因子的分析

3．讨论

课题研究总结

参考文献

论文综述 柯萨奇病毒A16型疫苗研究进展

附录

致谢

个人简历

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