MicroRNA130a通过调节干扰素信号通路及丙酮酸代谢调控HCV及HBV复制的机制研究

摘要

研究背景:
　　乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染是导致严重肝脏疾病的主要原因之一。目前，全球约有HBV慢性感染者2.57亿人，HCV慢性感染者7100万人，对公共健康造成严重的负担。目前，乙肝的治疗药物主要有干扰素和核苷类似物两种，干扰素治疗应答率低，而核苷类药物治疗易复发。丙肝治疗的传统方法为长效干扰素联合利巴韦林，但毒副作用大，且对HCV基因Ⅰ型病毒应答率低。近年，靶向HCV蛋白酶和聚合酶的直接抗病毒药物(Direct-acting Antivirals，DAAs)的飞速发展极大的提高了抗病毒应答率，但是一些不足之处也逐渐显现，如在HBV/HCV共感染的患者中，DAAs药物易造成HBV的复发，加之DAAs药物价格昂贵，因此，寻找新的抗病毒策略，尤其是能同时抵抗HCV和HBV两种病毒的广谱抗病毒策略，仍然是非常有必要的。
　　保持自身的代谢和激发免疫应答是宿主细胞在受到外界刺激，如病毒感染时，维持内稳态的两个方面。microRNAs在调节宿主代谢和免疫应答中均起着极为重要的作用。有研究显示，在HCV及HBV感染的病人肝组织及体外细胞培养模型中，miR-130a的表达发生明显的改变;同时有研究显示，miR-130a表达的改变对HCV及HBV的复制具有调节作用。在研究中发现miR-130a能调节Ⅰ型干扰素及其下游干扰素刺激基因的表达，同时miR-130a靶作用于丙酮酸激酶PKLR，调节PKLR的表达及其催化的丙酮酸生成反应。但是针对miR-130a调节HCV和HBV的复制及宿主免疫是否与丙酮酸代谢存在关联，目前尚不清楚。
　　研究目的:
　　1、探索miR-130a对HCV和HBV复制的影响;
　　2、鉴定miR-130a作用的靶基因;
　　3、阐述miR-130a调控HCV和HBV复制的分子机制。
　　研究内容:
　　第一部分miR-130a通过调节Ⅰ型干扰素信号通路调控HCV复制的研究;
　　第二部分miR-130a与维生素D协同抗HCV作用研究;
　　第三部分miR-130a通过调节靶基因PKLR的表达调控HCV和HBV复制的研究;
　　第四部分PKLR及丙酮酸调控HCV和HBV复制的研究。
　　研究方法:
　　1、将miR-130a模拟物(mimic)转染HCV复制子细胞（Con1b细胞）及JFH1感染的Huh7.5.1细胞（JFH1细胞），使miR-130a高表达，检测miR-130a高表达对内源性IFNα/β生成、干扰素刺激基因(ISGs)表达及HCV RNA复制的影响;在干扰素受体缺陷的细胞U5A中及其母细胞2fTGH中转染miR-130a模拟物，检测两种细胞中，ISGs的表达，明确miR-130a对ISGs表达的影响是否依赖于干扰素与其受体的结合。
　　2.在Con1b及JFH1感染的Huh7.5.1细胞中，加入骨化三醇（Calcitriol，VD的活性形式）处理、转染miR-130a模拟物或转染miR-130a模拟物的同时加入骨化三醇处理，检测骨化三醇、miR-130a对HCV复制、IFNα/β表达的影响，并检测二者是否具有协同作用。
　　3、采用四种预测软件(TargetScan、miRanda、RNAhybrid及PITA)对miR-130a可能发挥作用的靶基因进行预测，通过双荧光素酶报告基因实验对可能作用的三个靶基因(IL18BP、PKLR及LDLR)进行验证。在HCV复制子细胞OR6、JFH1感染的Huh7.5.1、JFH1感染的人原代肝细胞(PHHs)中或者HBV细胞系HepAD38、HBV感染的pNTCP-PHHs、HBV感染的pNTCP-Huh7.5.1细胞中，转染miR-130a模拟物(mimic)或者miR-130a表达抑制物(inhibitor)或者CRISPR/Cas/9gRNA，考察miR-130a过表达、抑制或基因沉默对HCV RNA复制、HBV DNA复制及对PKLR表达的影响。
　　4、靶基因功能研究，通过构建PKLR过表达质粒，将质粒转染细胞进行过表达或者通过小分子干扰RNA(siRNA)或CRISPR/Cas9技术使其沉默，检测PKLR过表达及沉默对HCV及HBV复制的影响。同时考察PKLR催化反应产物丙酮酸对HCV、HBV复制的影响，以及补充丙酮酸是否对miR-130a高表达及PKLR沉默引起的病毒复制的抑制具有营救效果。
　　研究结果:
　　1、JFH1感染的Huh7.5.1及HCV复制子细胞Con1b中，miR-130a过表达后，HCVRNA复制显著降低，Ⅰ型干扰素(IFNα/β)及一些ISGs基因(Mx1，CH25H)的表达显著增加，但miR-130a的表达不受IFNα刺激的影响。此外，在干扰素受体IFNAR2c缺失的U5A细胞中，miR-130a高表达对ISGs基因无上调作用，提示miR-130a对ISGs的调节是通过干扰素信号通路实现的。
　　2、骨化三醇不影响miR-130a的表达;miR-130a过表达及骨化三醇均显著抑制HCVRNA复制，两者具有一定的叠加作用。miR-130a过表达及骨化三醇均显著促进IFNα/β的表达，但在miR-130a过表达的同时加入骨化三醇，IFNα/β的表达低于单独处理组。miR-130a过表达及骨化三醇均显著抑制HCV入胞受体LDLR的表达及HCV的入胞吸附过程，且同时处理具有一定的叠加作用。这些结果提示，miR-130a过表达与骨化三醇的抗病毒叠加效应与Ⅰ型干扰素信号通路无关，很可能是通过调节病毒的吸附入胞实现的。
　　3、通过四种不同的软件对miR-130a可能作用的靶基因进行预测，获得2152个潜在的靶基因，其中有534个基因同时由2种以上的软件获得;通过文献检索的方法，从中筛选了116个与病毒感染及肝脏疾病相关的基因进行研究，通过荧光定量PCR的方法，发现，在miR-130a高表达的细胞中，PKLR（编码丙酮酸激酶，广泛存在于肝脏及红细胞中），IL18BP（编码白介素18结合蛋白），LDLR（编码低密度脂蛋白受体）三个基因的表达显著降低。对这三个基因，进行了双荧光素酶报告基因实验，结果证实PKLR为miR-130a的靶基因，而IL18BP和LDLR不是。miR-130a高表达显著抑制PKLR的表达和HCV、HBV的复制;miR-130a表达抑制或基因沉默显著促进PKLR的表达及HCV和HBV的复制。
　　4、PKLR过表达显著促进HCV及HBV的复制;PKLR基因沉默显著抑制HCV及HBV的复制。无丙酮酸培养基中培养的细胞，当向培养基中加入丙酮酸溶液后，HCV及HBV的复制显著增加，且在miR-130a过表达及PKLR沉默的实验组中加入丙酮酸，丙酮酸对miR-130a高表达及PKLR沉默导致的HCV、HBV复制的抑制具有营救作用。但是PKLR及丙酮酸处理均不影响miR-130a的表达，提示PKLR及丙酮酸位于miR-130a调节通路的下游。
　　研究结论:
　　1、miR-130a过表达显著抑制HCV及HBV的复制;而miR-130a表达抑制或基因沉默显著促进HCV及HBV的复制。miR-130a高表达与骨化三醇对HCV复制的抑制具有叠加效应。
　　2、miR-130a过表达上调IFNα/β的表达，通过与细胞表面的干扰素受体结合，激活下游ISRE及ISGs的表达。但miR-130a与骨化三醇的抗病毒叠加作用与Ⅰ型干扰素信号通路无关。
　　3、PKLR为miR-130a直接作用的靶基因，miR-130a通过调节PKLR的表达，影响其催化的丙酮酸生成过程，进而影响HCV和HBV的复制。
　　4、miR-130a对Ⅰ型干扰素通路的调控与PKLR的表达及丙酮酸生成无显著的关联。

目录

摘要

前言

乙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒

MicroRNAs

第一部分 miR-130a通过调节Ⅰ型干扰素信号通路调控HCV复制的研究

1．实验材料

2．实验方法

3．技术路线

研究结果

1．HCV感染后，细胞中miR-130a的表达显著增加

2．miR-130a高表达抑制HCV RNA的复制

3．miR-130a高表达促进Ⅰ型干扰素(IFNα／β)及干扰素刺激基因的表达

4．miR-130a对ISGs的上调作用依赖于IFN与细胞表面干扰素受体(IFNAR)结合

讨论

第二部分 miR-130a与维生素D协同抗HCV作用研究

材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

3．技术路线

研究结果

1．骨化三醇抑制HCV RNA的复制

2．骨化三醇显著增强miR-130a mimic的抗HCV作用

3．骨化三醇增强miR-130a抗HCV效果的机制探究

讨论

第三部分 miR-130a通过调节靶基因PKLR的表达调控HCV和HBV复制的研究

材料与方法

1、实验材料

2、实验方法

3．技术路线

研究结果

1．生物信息学方法预测miR-130a可能作用的靶基因

2．双荧光报告基因实验验证PKLR为miR-130a的靶基因

3．miR-130a通过调节靶基因PKLR的表达调控HCV的复制

4．miR-130a通过调节靶基因PKLR的表达调节HBV的复制

讨论

第四部分 PKLR及丙酮酸调控HCV和HBV复制的研究

材料与方法

1、实验材料

2、实验方法

3．技术路线

研究结果

1．PKLR调节HCV的复制

2．PKLR调节HBV的复制

3．丙酮酸在HCV复制中起着非常关键的作用

4．丙酮酸对miR-130a高表达引起的病毒复制的抑制具有营救作用

5．丙酮酸对PKLR gRNA引起的病毒复制的抑制具有营救作用

6．miR-130a对Ⅰ型IFN的调控不依赖PKLR通路

讨论

全文总结

1．实验结果

2．特色及创新之处

3．存在的不足及下一步研究计划

4．研究意义及展望

参考文献

文献综述 MicroRNAs调节丙肝病毒感染及抗病毒免疫研究进展

附录

致谢

声明