低能量激光对体外培养干细胞及毛囊生长的促进作用及Wnt10b/β-catenin信号通路的实验研究

摘要

研究背景:
　　低能量激光(low level laser，LLL)是一系列波长在600-1100nm，能量密度1-10J/cm2，功率密度为3-90mW/cm2的激光。低能量激光疗法(low level laser treatment，LLLT)不仅能够促进组织修复再生，还能够增强体外培养细胞的活性。有研究表明，LLLT对于部分细胞的增殖及迁移起到显著促进作用，是细胞体外扩增的有效手段。但目前研究尚未明确LLLT用于体外细胞扩增的最适参数。此外，LLLT因其促进毛发生长的作用，已在临床已被作为改善秃发症状的辅助治疗手段。然而产生这些生物学效应的机制仍不十分明确，成为限制LLLT应用一个重要因素。本研究旨在探索LLLT促进体外培养细胞扩增的最适参数，并探索其促进毛发生长的作用机制，为LLLT在临床更精准的应用奠定理论基础。
　　研究目的:
　　1、探求LLLT对体外培养干细胞，主要是人脂肪干细胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)及大鼠骨髓来源间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)生物学特性的影响。
　　2、探索LLLT对C3H/HeJ小鼠背部皮肤中毛囊的影响并探索其发生机制。
　　研究内容:
　　1、体外培养干细胞(SCs)体外增殖能力、细胞周期及凋亡水平的检测
　　方法:取人ADSCs及大鼠BMSCs细胞，将细胞于间充质干细胞培养基中培养。待细胞贴壁良好后，分别对两种细胞给予低、中、高剂量的LLLT照射，照射能量分别为39s，196s，392s。在LLLT照射后6h、12h、24h、48h后采用MTS法检测各组细胞活力，FACS法检测各组细胞的周期及凋亡水平。综合评价LLLT对体外培养人ADSCs及大鼠BMSCs细胞增殖能力的影响，并进一步比较剂量的高低对细胞的影响。
　　研究结果:
　　(1)LLLT对于体外培养的SCs有促进增殖的作用，该促进作用有一定的能量依赖性，即在一定范围内的LLLT能够促进SCs增殖，而超过该能量范围后LLLT对SCs的增殖并无明显促进作用;
　　(2)LLLT对体外培养SCs的促进作用对于不同细胞效果相异，在大鼠BMSCs和人ADCSsLLLT起效时间不同:大鼠BMSCs在LLLT刺激后12h即出现增殖显著增加，24h时仍有促进作用，48h时促进作用基本消失;而人ADSCs细胞则在LLLT刺激后24h才开始出现增殖显著增加，48h时作用基本消失;;
　　(3)较高能量的LLLT能够增加SCs细胞（大鼠BMSCs、人ADSCs）的细胞凋亡水平。
　　2、体外培养人ADSCs及大鼠BMSCs细胞迁移能力的检测
　　方法:取人ADSCs及大鼠BMSCs细胞生长达80％-90％融合后用于实验，行划痕实验，观察并分析迁移能力。
　　研究结果:
　　(1)低剂量的LLLT能够使人ADSCs细胞的迁移能力增强，中、高剂量的LLLT并不会削弱ADSCs的迁移能力。
　　(2)低剂量的LLLT对大鼠BMSCs细胞的迁移能力无影响，中、高剂量的LLLT减弱大鼠BMSCs细胞的迁移能力。
　　3、LLLT照射对C3H/HeJ小鼠背部毛囊的作用及其机制初探
　　方法:取雌性C3H/HeJ小鼠，随机分为两组:激光照射组（LLLT组），对照组（CNTL组），所有小鼠均行背部脱毛处理。腹腔注射EdU溶液后，即刻给予LLLT照射。LLLT照射后4h，1d，2d，5d，7d，10d，15d，20d，进行取材行组织学染色、rt-PCR及western blot检测后对结果进行统计学分析。
　　结果:LLLT能够诱导C3H/HeJ小鼠背部皮肤中处于休止期的毛囊进入生长期，该作用可能是通过激活Wnt10b介导的Wnt10b/β-catenin信号转导通路实现。
　　研究结论:
　　1、较低能量的LLLT能够通过诱导G0/G1期细胞进入DNA复制阶段，对这两种细胞起到促进增殖的作用，并且无诱导细胞凋亡的作用;高能量的LLLT不仅对该两种细胞的增殖无正性作用，反而会增加细胞的凋亡水平。
　　2、从细胞迁移能力方面观察，LLLT对于BMSCs作用:在剂量较高时，LLLT会抑制BMSCs的迁移能力，而低剂量无明显影响。对于ADSCs作用:低剂量的LLLT能够使细胞的迁移能力增强，并且过高剂量的LLLT不会削弱ADSCs的迁移能力。
　　3、LLLT能够促进小鼠背部毛发的生长，其作用机制可能为促进了毛囊由休止期向生长期转换，同时促进了毛囊细胞的增殖，该促进作用可能与Wnt10b/β-catenin信号转导通路密切相关，通过上调Wnt10b、β-catenin、LEF1等Wnt10b/β-catenin信号通路关键蛋白水平而实现。

目录

摘要

前言

第一部分 不同剂量LLLT照射对体外培养干细胞生物学特性的影响

一、体外培养干细胞(SCs)体外增殖能力、周期及凋亡水平的检测

1、实验材料

2、实验方法

3、统计分析

4、实验结果

5、讨论

6、小结

二、体外培养干细胞迁移能力的研究

第二部分 LLLT照射对C3H／HeJ小鼠背部毛囊的影响及其产生机制的研究

1、实验材料

2、实验方法

3、统计分析

4、实验结果

5、讨论

6、小结

全文总结

文献综述 低能量激光的生物学作用及其发生机制的研究进展

参考文献

致谢

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