生物工程化人唾液腺类器官构建的实验研究

摘要

口干症等唾液腺疾病严重影响人类的身体健康和生活质量。迄今为止，主要通过保守治疗改善症状，尚无一种根本有效的治疗方法。干细胞治疗或生物工程化唾液腺类器官的构建为其治疗提供了新的方法和思路。近些年来，唾液腺来源的干细胞相关研究成为新热点，研究方向主要集中于大涎腺。与之不同的是，课题组基于小涎腺组织具有数量多、分布广泛、来源丰富、解剖部位浅、取材方便、供区隐蔽等优点，率先开展了人小涎腺来源的干细胞研究，从小涎腺中分离培养并鉴定上皮干/祖细胞和间充质干细胞两种成体干细胞。在本实验中，应用人小涎腺来源的上皮干/祖细胞和间充质干细胞进行生物工程化人唾液腺类器官的体内外研究，在组织细胞学、分子生物学水平对重构的人唾液腺类器官的形态结构和功能进行初步分析。人唾液腺类器官体内外模型的建立，将对唾液腺的发育、生理功能、唾液成分分析和唾液腺疾病发生机制等研究具有重要的理论意义和转化价值。
　　目的：
　　1.人小涎腺组织分离培养和鉴定后的上皮干/祖细胞和间充质干细胞进行体外三维培养，探讨体外构建具有一定功能和功能的生物工程化人唾液腺类器官的可行性。
　　2.将人小涎腺组织分离培养和鉴定后的上皮干/祖细胞和间充质干细胞移植入小鼠体内，构建人唾液腺类器官的体内模型。
　　内容：
　　1.生物工程化人唾液腺类器官的体外重构
　　方法：人小涎腺上皮干/祖细胞和间充质干细胞在基质胶Matrigel内进行分别和混合三维培养。以平面培养作为对照，观察其形态学变化，RT-PCR方法检测各组内不同时相和组间的AMY1、AQP5、MUC5B、LZM、CK14、CK15、CK19和Ki67基因表达变化;收集平面培养和立体培养的第6天、12天、18天、24天和30天上清液，应用ELISA试剂盒检测AMY1和LZM的分泌水平变化;标本进行HE染色，应用免疫荧光检测AQP5、CK14、CK15、CK19、CD44、CD166、Calponin、Claudin1、NKCC1、E-cadherin、ZO-1、α-SMA和NF-H等目标蛋白的表达。
　　结果：
　　hMSGSC与hMSGMSC混合接种至Matrigel后36-48小时左右后即可观察到兼有导管和腺泡样结构的类器官形成，而两种细胞单独接种时均不能形成导管分支样结构的类器官体。两种细胞通过不同荧光蛋白分别标记并体外立体培养后，在共聚焦显微镜下可以观察到形成类器官体中导管和腺泡样结构主要由hMSGSC构成。
　　hMSGSC组AMY1、AQP5、LZM和MUC5B表达高于hMSGMSC和hMSGSC+hMSGMSC组，hMSGSC+hMSGMSC组的AMY1水平高于hMSGMSC组。hMSGSC和hMSGSC+hMSGMSC组CK14、CK15和CK19表达量高，hMSGMSC组表达量极低;Ki67的表达量从高到低为hMSGMSC、hMSGSC和hMSGSC+hMSGMSC，立体培养后表达量降低。
　　hMSGSC+hMSGMSC组HE染色可见末端膨大的球状细胞团和其间相互连接的分支样结构。小涎腺组织腺管位置表达的CK15、CK19，在腺泡表达的CD44，腺泡和腺管位置均表达的CK14，在hMSGSC平面培养和立体培养、hMSGSC+hMSGMSC立体培养时均表达。hMSGSC和hMSGSC+hMSGMSC立体培养还高表达在小涎腺腺泡部位特异表达的AQP5。hMSGMSC平面和立体培养基本未见表达。
　　hMSGSC+hMSGMSC组上清液中LZM的浓度均明显高于hMSGSC组，hMSGMSC组上清液原液LZM浓度过低基本检测不到。hMSGMSC和hMSGSC+hMSGMSC组上清液中AMY1的浓度均高于hMSGSC组;前两组之间多数时相点分泌浓度无明显差别。
　　结论：
　　hMSGSC与hMSGMSC体外立体共培养后可以观察腺泡和导管样结构的分支状形态、表达相关免疫表型、具有一定功能的人唾液腺类器官。
　　2.生物工程化人唾液腺类器官构建的体内研究
　　方法：
　　将人小涎腺组织上皮干/祖细胞、间充质干细胞体外分别、共同种植于SD大鼠鼠尾胶原内，体外培养3-5天后，同时将空白大鼠鼠尾胶原和新鲜人小涎腺组织分别作为对照，移植入裸鼠皮下。体内移植实验后2周、4周分别予以取材，行切片HE、PAS染色和免疫荧光检测。
　　结果：
　　取材标本内可见标记过的人小涎腺干细胞。鼠尾胶原空白组可见少量细胞浸润。HE染色和PAS染色发现只有hMSGSC+hMSGMSC混合组在体内血管化较好，形成较为明显腺管样结构，其周缘可见空泡状类腺泡结构。免疫荧光检测可见腺泡较为特异性表达的AQP5、CD166(4周)和Calponin在网格样结构表达，腺管特异性标记CK19均在腺管样结构中表达。人小涎腺在裸鼠体内移植后，小涎腺原有的腺泡和腺管均萎缩较明显，但在周缘可见与hMSGSC+hMSGMSC混合组体内移植相似的腺管样结构。
　　结论：
　　hMSGSC和hMSGMSC混合共培养体内移植可成活，并形成有典型腺管样结构和空泡状类腺泡结构的人唾液腺类器官。

目录

摘要

第一部分 生物工程化人唾液腺类器官构建的实验研究

前言

第一章 生物工程化人唾液腺类器官的体外重构

1．实验组织和细胞

2．实验试剂与耗材

3．主要仪器

4．实验方法

5．数据统计

6．实验结果

7．讨论

第一部分第一章 附录

第二章 生物工程化人唾液腺类器官构建的体内研究

1．实验组织、细胞和实验动物

2．实验试剂

3．实验仪器

4．实验方法

5．实验结果

6．讨论

第一部分第二章 附图

第一部分总结

参考文献

综述 唾液腺调控信号通路的相关研究

第二部分 丝线结扎延迟—新型有效的皮瓣外科延迟技术

摘要

Abstract

前言

1．患者和方法

2．结果

3．典型病例

4．讨论

5．结论

参考文献

缩略词

致谢

声明