中国汉族人群大动脉炎候选基因的关联分析和采用高通量蛋白芯片筛选新的血清自身抗体的研究

摘要

本文主要从以下几部分进行论述：
　　第一部分 中国汉族人群大动脉炎候选基因单核苷酸多态性的关联分析研究
　　目的：大动脉炎(Takayasu arteritis，TA)是一种主要累及主动脉及其分支的自身免疫性疾病，遗传机制在其发病中起重要作用。全基因组关联分析研究(genome-wideassociation study,GWAS)发现IL12B、IL6、HLA-B/MICA、FCGR2A/FCGR3A和RSP9/LILRB3、MICA、EEFSEC、RIPPLY2和MLX的单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphisms，SNP)与TA相关。由于TA发病具有种族差异性，本研究的目的是探讨这些GWAS报道的基因多态性是否与中国汉族人群的TA相关。
　　方法：本研究为多中心大样本研究，共有412例TA患者和597例健康对照参与其中。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）方法对以下基因的14个SNP位点进行基因分型:IL12B(rs6871626、rs4921492、rs60689680和rs4921493)、IL6(rs2069837)、HLA-B/MICA(rs9366782和rs12524487)、MICA(rs3763288和rs114202986)、FCGR2A/FCGR3A(rs2099684)、RSP9/LILRB3(rs11666543)、EEFSEC(rs10934853)、RIPPLY2(rs1570843)和MLX(rs665268)。同时探讨这些SNP与TA疾病早发和伴发高血压的关系。
　　结果：IL12B基因的位点rs6871626、rs4921492、rs60689680和rs4921493的最小等位基因都与TA相关(OR=1.52，95％CI=1.26-1.81;OR=1.46，95％ CI=1.21-1.75;OR=1.41，95％ CI=1.17-1.69;OR=1.45，95％ CI=1.21-1.75)。这四个位点基因型也都与TA相关（P=1.14×10-5，P=1.67×10-4，P=4.36×10-4和P=1.91×10-4）。四个SNP呈强连锁遗传，构成的单体型AATC在疾病组的频率高于对照组（P=4.61×10-4），疾病组单体型CCGT的频率低于对照组(P=4.69×10-5)。HLA-B/MICA的rs9366782和s12524487与TA相关（P=0.028和P=0.01）。rs12524487的基因型与TA相关（P=0.011）MICA的rs3763288和rs114202986与TA不相关。由rs9366782、s12524487、rs3763288和rs114202986构成的单体型ATGT在疾病组的频率高于对照组（P=6.2×10-11），单体型TTAC在疾病组的频率低于对照组（P=0.026）。条件分析发现rs12524487对TA的作用不依赖于其他3个SNP。 FCGR2A/FCGR3A的s2099684等位基因和基因型都与TA相关（P=3×10-9和P=9.8×10-8）。RSP9/LILRB3的rs11666543的基因型GG/AA+AG与TA有关(P=0.033，OR=1.43，95％CI=1.10-2.0)。IL6的rs2069837、EEFSEC的rs10934853、RIPPLY2的rs1570843和MLX的rs665268与中国汉族人群的TA不相关。IL6的rs2069837和RSP9/LILRB3的rs11666543与TA伴发高血压相关(OR=2.12，95％ CI=1.32-3.44; OR=1.74，95％CI=1.01-2.97)。未发现这些基因的多态性与TA疾病早发的关系。
　　结论：本研究表明IL12B、HLA-B/MICA、FCGR2A/FCGR3A和RSP9/LILRB3可能是中国汉族人群TA的易感基因。IL6和RSP9/LILRB3与中国汉族人群TA伴发高血压相关。
　　第二部分 采用高通量蛋白芯片筛选大动脉炎新的血清自身抗体的研究
　　目的：大动脉炎（Takayasu arteritis，TA）是一种主要累及主动脉及其分支的自身免疫疾病。由于起病隐匿、早期症状不典型且临床上缺乏可靠的标志物，TA的诊断常常造成延误。因此本研究拟采用包含20，240种人类蛋白的HuProt芯片来全面筛选TA特异性的血清标志物以帮助TA诊断。
　　方法：采用二阶段的筛选策略，即筛选阶段和验证阶段。第一阶段采用HuProt高通量蛋白芯片在小样本中筛选TA候选自身抗原，包括40例TA患者，15例自身免疫病对照患者和20例健康对照。经生物信息学分析得到43种TA相关自身抗原。第二阶段将这43种抗原纯化和制备成TA靶抗原蛋白小芯片，在大样本中进行验证，包括109例TA患者（稳定期78例，活动期31例），110例自身免疫病对照患者（包括RA患者50例，ANCA相关血管炎患者37例和SS患者23例）和96例健康对照的血清进行临床扩大样本验证。最后为了确保方法学可靠性，我们纯化了验证得到的8个标志物中的3个，SPATA7，QDPR和PRH2，在每组代表性样本中进行Western blot验证。
　　结果：经过筛选和验证后得到8种TA特异性自身抗原，分别为SPATA7，QDPR，SLC25A22，PRH2，DIXDC1，IL17RB，ZFAND4和NOLC1。两种自身抗原SPATA7和QDPR的AUC最高分别为0.803和0.801。SPATA7以73.4％的灵敏度和85.4％的特异性与疾病对照和健康对照分开，QDPR的灵敏度和特异性分别为71.6％和86.4％。8个标志物中SLC25A22的灵敏度最高为80.7％，而特异性稍差为67.0％。PRH2，IL17RB和NOLC1的特异性较高＞85％，而特异性较差＜50％。其余两个标志物DIXDC1和ZFAND4的灵敏度分别为67.％和50.5％，特异性分别为65.5％，77.7％。这8个标志物的联合使用与单个标志物SPATA7和QDPR相比AUC、灵敏度和特异性都没有提高。且这8个标志物与TA的活动性都无关。3个标志物SPATA7,QDPR和PRH2在各组代表性样本中成功验证。
　　结论：采用两阶段的筛选策略，在390例大样本人群中发现和验证了8个新的TA血清学标志物，能够帮助TA的诊断。3个标志物SPATA7，QDPR和PRH2已经具备应用于临床的可能性。

目录

声明

英文缩略词表

第一部分 中国汉族人群大动脉炎候选基因单核苷酸多态性的关联分析研究

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 研究对象

2．2 实验材料

2．3 主要分析软件和电子数据库查询信息

2．4 实验方法

2．5 统计分析

第二章 实验结果

2．1 基本资料

2．2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果

2．3 各基因SNP位点等位基因和基因型的分析

2．4 在三种遗传模型下对各个基因SNP位点的分析

2．5 IL12B的SNP rs6871626的Meta分析

2．6 连锁不平衡、单体型分析和条件性单体型分析

2．7 各基因SNP位点和TA疾病早发和伴发高血压的相关性分析

第三章 讨论

3．1 IL12B基因与TA的相关性

3．2 IL6基因与TA的相关性

3．3 HLA区域各SNP位点与TA的相关性

3．4 FCGR2A／FCGR3A基因与TA的相关性

3．5 RSP9／LILRB3基因与TA的相关性

3．6 EEFSEC、RIPPLY2和MLX与TA的相关性

3．7 本研究的创新点与局限性

第四章 结论

参考文献

第二部分 采用高通量蛋白芯片筛选大动脉炎新的血清自身抗体的研究

摘要

第一章 前言

2．1 研究对象

2．2 主要试剂和仪器

2．3 主要分析软件

2．4 实验方法

3．1 实验设计

3．2 HuProt高通量蛋白芯片质量检测结果

3．3 采用HuProt高通量蛋白芯片筛选大动脉炎相关自身抗体

3．4 大动脉炎相关自身抗体靶抗原定制小芯片的质量检测

3．5 采用大动脉炎自身抗体靶抗原蛋白芯片验证候选自身抗原

3．6 血清自身抗体与大动脉炎活动性的相关性

3．7 纯化抗原的Western blot检测

3．8 转化应用于Western blot

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 大动脉炎的易感基因和生物标志物的研究进展

个人简介

致谢