FGF2调控软骨下骨活性促进关节软骨损伤修复的研究

摘要

由于缺少血供，关节软骨损伤难以修复，最终会发展为骨性关节炎甚至运动障碍。目前，关节软骨损伤后的再生修复是临床医学的一个巨大挑战，也是再生医学研究的一个热点。多种生长因子参与了关节软骨的形成及发育过程，它们也被广泛应用于关节软骨损伤修复的研究中。本课题组在前期构建了一种时空控释碱性成纤维细胞生长因子(bFGF/FGF2)的胶原基复合材料发现，FGF2是通过上调内源性生长因子表达水平进而促进了关节软骨的损伤修复。进一步分析研究结果，推测上调的骨形态发生蛋白2和4（BMP2和BMP4）是FGF2促进关节软骨修复的主要原因。近期，通过实时定量PCR(qRT-PCR)，发现升高的骨形态发生蛋白2(BMP2)和BMP4主要来源于软骨下骨，提示FGF2是通过调控软骨下骨活性，上调其BMP表达水平、进而促进了关节软骨的损伤修复。还发现BMP2和BMP4的受体竞争性抑制分子BMP3加重模型动物损伤区软骨下骨的破坏程度，抑制关节软骨修复。基于以上发现，提出了软骨下骨在关节软骨损伤修复中具有重要作用，FGF2可以调控其活性进而促进关节软骨的损伤修复，靶向递送FGF2至软骨下骨可以改善关节软骨缺损的修复。本研究针对这一假说开展了研究工作，首先通过软骨下骨区域直接注射FGF2考察了其对关节软骨修复的作用;进一步在此基础上，结合前期研究工作基础，构建了一种具有定向释放FGF2的胶原基复合材料，使FGF2可以只作用于软骨下骨;最后通过动物实验考察该复合材料对关节软骨损伤修复的影响及其机制。通过本研究工作，以期为FGF2在关节软骨损伤修复中的合理应用提供新思路，也为关节软骨损伤修复机制的深入理解提供新的依据。现阶段主要研究结果和结论如下:
　　1.本研究首先通过关节软骨缺损区域直接注射低剂量FGF2至软骨下骨局部并联合应用BMP信号通路抑制剂Dorsomorphin，研究和分析了FGF2在关节软骨损伤修复中的作用及其机制。研究发现，FGF2是通过调控软骨下骨的BMP信号通路，促进软骨的再生修复;而Dorsomorphin由于抑制了BMP信号通路，减弱了FGF2促进关节软骨修复的作用。
　　2.为了进一步考察软骨下骨在FGF2促进关节软骨修复中的作用，又构建了一种定向释放FGF2的胶原基复合材料。通过纤维蛋白胶与胶原特异性相互作用的特点，结合物理吸附法构建了定向释放FGF2的胶原基双层膜材料，该胶原基双层膜具有表层致密的上层胶原膜和具有疏松结构的下层胶原膜，FGF2负载于下层疏松胶原膜。体外释放研究发现，双层膜所负载的分子具有定向释放的特点。
　　3.本研究将上述定向释放FGF2的胶原基复合材料植入家兔关节软骨损伤区域。通过酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测收集到的复合材料植入后的动物关节液，发现定向释放FGF2的胶原基复合材料植入组的早期BMP2和BMP4的含量较对照组显著升高。进一步证实了早期的研究，FGF2可以上调BMP2和BMP4的表达水平。
　　4.最后，本研究将上述定向释放FGF2的胶原基复合材料植入家兔关节软骨损伤区域，考察了该材料对关节软骨损伤修复的影响。研究发现，与对照组相比，该材料在植入8周后明显改善了关节软骨损伤修复的效果，有效促进了透明软骨和软骨下骨组织的再生以及新生组织与周围组织的整合。
　　综上所述，本文证明了软骨下骨在关节软骨修复过程中具有重要作用，FGF2通过调控软骨下骨活性、上调BMP2和BMP4的表达水平，从而促进关节软骨的损伤修复;本研究成功构建了具有定向释放FGF2作用的胶原基双层膜材料，显著改善关节软骨的损伤修复效果。因此，由于其作用机理相对明确、使用剂量可以相对减少，并且作用周期较短，本研究所构建的定向释放FGF2的胶原基复合材料可能成为一种有应用前景的促进关节软骨修复的新型生物材料。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1．1 关节软骨

1．1．2 软骨下骨

1．1．3 软骨细胞

1．2 关节软骨损伤

1．2．1 软骨损伤的分类

1．2．2 软骨损伤的治疗

1．3 生长因子在关节软骨损伤修复中的应用

1．3．1 关节腔注射

1．3．2 转染

1．3．3 靶向缓、控释

1．4 课题的提出

参考文献

第二章 FGF2及其联合BMP信号通路抑制剂对关节软骨损伤修复的影响

2．1 前言

2．2 试剂与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器与设备

2．3 实验方法

2．3．1 实验动物及分组

2．3．2 胶原材料的制备

2．3．3 手术过程及低剂量FGF2和Dorsomorphin的应用

2．3．4 取材与组织切片染色

2．3．5 组织学评分

2．4 结果

2．4．1 组织样本及组织切片的观察

3．4．2 组织样本及组织切片的评价

2．5 讨论

2．6 本章小结

参考文献

第三章 定向释放FGF2的胶原基复合材料的制备

3．1 前言

3．2．1 试剂与材料

3．2．2 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 致密胶原膜的制备

3．3．2 疏松胶原膜的制备

3．3．3 致密、疏松胶原膜的复合

3．3．4 胶原膜的表征

3．3．5 胶原基复合材料对生长因子释放行为的研究

3．4 结果

3．4．1 胶原基双层膜的表征

3．4．2 胶原基双层膜释放结果

3．5 讨论

3．6 本章小结

参考文献

第四章 定向释放FGF2胶原基复合材料对损伤修复的作用

4．1 前言

4．2 试剂与仪器

4．2．1 试剂

4．2．2 仪器与设备

4．3 实验方法

4．3．1 双层膜负载FGF2

4．3．2 实验动物及分组

4．3．3 手术过程及胶原膜材料的植入

4．3．4 关节液的Elisa检测

4．3．5 取材与组织切片染色

4．3．6 组织学评分标准

4．4 结果

4．4．1 关节液成分的变化

4．4．2 组织样本的观察

4．4．3 组织切片的观察

4．4．4 损伤修复的评价

4．5 讨论

4．6 本章小结

参考文献

全文总结

在学期间所获成果

致谢