HBV相关肝纤维化组织的蛋白质组学和转录组学研究

摘要

背景：
　　肝纤维化（Liver fibrosis）是一种世界范围内的高发病率与高死亡率的肝脏疾病，由于肝纤维化具有可逆性，针对肝纤维化的研究已成为近年来肝脏疾病研究的热点。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是引起肝纤维化的重要因素之一。但是，HBV持续性感染引起的肝纤维化的机制仍未明确。因此，进一步阐述HBV相关肝纤维化的分子机制，对于诊断和治疗具有重要的意义。
　　目前，蛋白质组学和转录组学在肝脏及其相关疾病研究中得到了广泛的应用。应用蛋白质组学方法，已经鉴定到了一系列与肝纤维化相关的分子标志物，肝纤维化的机制也被不断完善。高通量测序技术(RNA-Seq)也被广泛应用于疾病发病机制的研究以及分子标志物的筛选等方面。但是，将RNA-Seq技术应用于HBV相关肝纤维化发病机制研究的报道尚少。因此，综合利用高通量的蛋白质组学和转录组学方法，研究肝纤维化过程中基因和蛋白质的变化，将有助于发现新的潜在的分子标志物，并进一步阐述肝纤维化的分子机制。
　　目的：
　　1、应用蛋白质组学方法，分析HBV持续性复制并伴有肝纤维化的模型小鼠肝脏组织中蛋白质的表达变化，鉴定出与肝纤维化相关的差异表达的蛋白质。
　　2、应用转录组学方法，分析HBV持续性复制并伴有肝纤维化的模型小鼠肝脏组织中基因的转录变化，鉴定出与肝纤维化相关的差异转录的基因。
　　3、运用生物信息学方法综合分析蛋白质组学和转录组学数据，进一步阐述HBV相关的肝纤维化的分子机制。
　　方法:
　　1、将AAV8-1.2HBV重组病毒尾静脉注射C57BL/6小鼠。在AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的不同时间点采集小鼠血液及肝脏组织样本，检测血清和肝组织中HBV DNA以及肝纤维化相关指标的变化，通过免疫组织化学染色等方法分析模型小鼠肝组织的病理变化及肝纤维化进程。
　　2、在AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的1、3、6个月，对小鼠肝脏组织总蛋白质进行二维凝胶电泳分析。经过图像分析后，采集差异表达的蛋白质点，进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定;对差异表达的蛋白质进行gene ontology、KEGGpathway以及蛋白与蛋白相互作用分析。
　　3、在AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的1、3、6个月，采集小鼠肝脏组织样本并提取总RNA、构建cDNA文库。使用2×150bp配对末端构型进行测序并与参考基因组比对。测序结果进行基因表达水平分析，获得差异基因，并进行geneontology、KEGG pathway以及蛋白与蛋白相互作用分析。
　　4、综合分析转录组学和蛋白质组学结果，找到重叠的差异表达的蛋白质，并进行DAVID聚类分析以及Western Blot和RT-qPCR验证。通过生物信息学分析，进一步阐述HBV相关肝纤维化的机制。在HSC LX-2细胞系中，应用RT-qPCR和siRNA技术对炎症相关基因Nlrp1进行初步的研究。
　　结果：
　　1、AAV8-1.2HBV重组病毒注射后的1～6个月，小鼠的肝脏组织和血清中均可以检测出较高浓度的HBV DNA，模型小鼠表现出病毒血症。病理切片及肝纤维化指标检测显示，小鼠肝组织没有明显的急性炎症反应，但是出现了慢性炎症反应和肝脏脂肪变性，HBsAg和HBeAg积累，肝组织形成了肝纤维化。
　　2、通过蛋白质组学分析，鉴定出173个差异表达的蛋白质。生物信息学分析表明，差异表达的蛋白质主要定位于细胞的线粒体，参与了Reactive oxygen species、ATP的合成等生物过程，并且被富集在NOD-like receptor signaling pathway、RIG-Ⅰ-like receptor signaling pathway以及apoptosis等信号通路中。蛋白与蛋白相互作用结果显示，差异表达的蛋白在氨基酸代谢，免疫调节和氧化应激反应中发挥作用。
　　3、通过转录组学分析，共鉴定到213个一致上调转录的基因以及109个下调转录的基因。生物信息学分析表明，一致上调转录的基因主要参与酸代谢，被富集到了细胞外组分中，并且参与了Drug metabolism-cytochrome P450等信号通路;一致下调的基因主要参与了脂质代谢，并且被富集到过氧化物酶体及微体中，主要参与了脂肪细胞因子等信号通路;蛋白与蛋白相互作用结果显示，PI3K/AKT、JaK/STAT等信号通路异常。
　　4、将差异表达的蛋白与差异转录的基因进行匹配分析，发现28个重叠的差异表达的蛋白质。28个重叠的蛋白高度富集到谷胱甘肽代谢、氧化还原反应、天然免疫以及Wnt信号通路中。参与氧化压力调控的蛋白质CAT、GSTP1、PRDX1、NXN、BLVRB以及IDH1的转录和表达均发生了明显的改变。上述蛋白质可能通过泛素化修饰来调节其活性，特别是UBC可能是重要的调节蛋白。在HSC LX2细胞系中，沉默Nlrp1能够抑制TGF-β1的表达。
　　结论：
　　1、本研究建立了乙型肝炎病毒持续性复制并伴有肝纤维化的小鼠模型，该模型表现出病毒血症、慢性炎症以及肝脏的脂肪变性和肝纤维化，与人乙型肝炎病毒慢性感染所引起的肝纤维化更为接近，为慢性乙型肝炎相关的肝纤维化机制的研究提供了良好的动物模型。
　　2、本研究应用蛋白质组学和转录组学方法，从蛋白质和RNA两个水平对HBV相关肝纤维化的发病机制进行了分析，揭示了氧化压力在肝纤维化生成过程中的重要作用，以及CAT、BLVRB、NXN、PRDX1以及IDH1对氧化压力的调控作用。这一结果为深入理解HBV相关肝纤维化的发生发展机制奠定了基础。
　　3、在肝纤维化机制的初步研究，应用siRNA沉默Nlrp1能够抑制TGF-β1的表达。

目录

声明

摘要

前言

1．乙型肝炎病毒相关肝纤维化的研究现状

1．2 肝纤维化的机制

2．蛋白质组学在肝脏疾病中的应用

2．1 蛋白质组学在肝炎研究中的进展

2．2 蛋白质组学在肝纤维化和肝硬化研究中的进展

3．转录组学在肝脏疾病中的应用

4．肝纤维化动物模型

5．本研究的目的与意义

6．本研究的技术路线

第一部分 HBV持续性复制并伴有肝纤维化的小鼠模型的建立

1．实验材料

1．3 扩增引物

1．4 主要的分子生物学及生化试剂

1．5 主要缓冲液及试剂配制

1．6 主要仪器设备及耗材

2．实验方法

2．2 AAV8-1．2HBV重组病毒的定量

2．3 HBV持续性复制并伴有肝纤维化的小鼠模型的建立

2．4 小鼠肝脏组织的病理学分析

3．结果与分析

3．1 AAV8可以介导HBV基因组在小鼠体内长期复制

3．2 AAV8能有效介导HBV基因在小鼠体内长期表达

3．3 AAV8-1．2HBV重组病毒注射不引起急性炎症反应

3．4 AAV8-1．2HBV重组病毒注射诱导小鼠形成肝纤维化

4．讨论

第二部分 HBV相关肝纤维化模型小鼠肝脏组织的蛋白质组学研究

1．实验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要试剂盒

1．4 主要试剂的配制

2．实验方法

2．3 二维凝胶电泳(2-DE)分析

2．4 2DE凝胶的银染

2．5 凝胶扫描与分析

2．6 蛋白质点的原位酶解

2．7 MALDI-TOF／TOF肽质量指纹图谱分析

2．8 蛋白质鉴定数据库搜寻

2．9 生物信息学分析

3．结果与分析

3．1 肝脏组织的二维凝胶电泳分析

3．2 差异蛋白点的PMF MS／MS检索与分析

3．3 生物信息学分析

4．讨论

第三部分 HBV相关肝纤维化模型小鼠肝脏组织的转录组学研究

1．实验材料

1．2 主要试剂盒

2．1 RNA测序样本的准备

2．2 RNA测序

2．3 RNA测序结果分析

3．结果与分析

3．1 肝脏组织中RNA纯度和完整性的鉴定结果

3．2 测序结果与参考序列的比对分析

3．3 差异转录基因的筛选

3．4 差异基因的GO富集分析

3．5 KEGG Pathway富集分析

3．6 蛋白与蛋白相互作用网络分析

4．讨论

1．实验材料

1．2 主要试剂与试剂盒

2．1 生物信息学分析

2．2 差异蛋白和差异基因的验证

2．3 LX2细胞的复苏和传代

2．4 siRNA转染

2．5 TGFβ-1表达水平的RT-qPCR分析

3．结果与分析

3．1 蛋白质组学和转录组学结果的匹配分析

3．2 重叠蛋白的生物信息学分析

3．3 重叠蛋白的验证

4．讨论

结论

参考文献

博士期间发表文章情况

附录

致谢