体外细胞培养模型中新型肾毒性生物标志物的研究

摘要

急性肾损伤是指肾功能的急剧下降，包括但不局限于急性肾衰竭。在临床上，药物诱发的急性肾损伤占所有肾损伤病例的33％左右。而在新药研发过程中，药物肾毒性往往是候选药物被迫中断后续开发的主要原因之一，如何快速准确地评价肾毒性已成为药物研发中的一个重要问题。近年来，在临床和临床前大鼠肾损伤研究中，一些新型肾毒性生物标志物已被证实在早期检测和灵敏度上都要优于传统的肌酐和尿素氮，并且具有损伤部位的特异性。但随着对实验动物“3R”原则的倡导与实施，以及动物与人体种属差异性造成的临床前数据外推至人体的局限性，建立准确、高通量的体外评价替代方法，已逐渐成为肾毒性研究的一个发展趋势。这些新的生物标志物能否在体外评价中更加准确、灵敏地预测肾毒性尚有待研究。
　　随着中药在临床上的广泛应用，中药引起的肾损伤日益受到人们的重视，是继抗生素、解热镇痛药以外药物性肾损害的重要病因之一，已成为制约中药现代化和临床应用的一大障碍。中药成份复杂、靶点多，引起肾毒性的病理表现和毒性机制更为复杂多样，而采用动物实验对中药成份进行毒理学研究则耗时耗力。因此，寻找准确可靠的中药肾毒性体外毒性评价方法也是中药现代化的发展趋势。
　　为了探求在肾毒性体外评价模型中更为灵敏、特异的早期检测指标，并建立中药肾毒性体外评价体系。本课题采用肝肾毒性药物，建立药物肾毒性的体外评价模型，筛选肾细胞模型中潜在的肾毒性生物标志物，比较各检测指标在不同肾细胞模型上对肾毒性的预测效能，并初步探索新型生物标志物在中药肾毒性体外评价中的应用。
　　以肾毒性药物庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ和环孢素为阳性工具药，以肝毒性药物环磷酰胺、硫唑嘌呤和无肝肾毒性药物左旋多巴为阴性对照，考察药物对L-02细胞、MDCKⅡ细胞、HK-2细胞和RPTEC/TERT1细胞的毒性作用。肾毒性药物庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ和环孢素在L-02细胞中半数抑制浓度(IC50)值高于MDCKⅡ细胞、HK-2细胞和RPTEC/TERT1细胞;肝毒性药物硫唑嘌呤和环磷酰胺在L-02细胞中IC50值低于MDCKⅡ细胞、HK-2细胞和RPTEC/TERT1细胞;阴性对照药物左旋多巴在四种细胞的IC50值都大于10000μM。肝毒性和肾毒性药物在肝肾细胞上IC50值的差异，可初步筛选药物的潜在靶器官毒性。另外，分别选择肾毒性药物庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ和环孢素各自IC50的1/5和2/5浓度处理四种细胞24 h，均能诱导细胞早期凋亡，且凋亡率具有浓度依赖性，说明肾毒性药物对肝肾细胞的细胞毒性作用是由凋亡诱导的。这些结果为生物标志物的筛选确定了合适的药物浓度。
　　在肾毒性药物庆大霉素、顺铂、马兜铃酸Ⅰ和环孢素诱导MDCKⅡ细胞、HK-2细胞和RPTEC/TERT1细胞发生凋亡的情况下，检测传统酶学生物标志物和新型生物标志物的水平，筛选出了潜在的高灵敏度生物标志物。相对于溶媒对照组，在MDCKⅡ细胞，药物组的新型生物标志物丛生蛋白(clusterin)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CysC)、骨桥蛋白(osteopontin)和传统酶学生物标志物乳酸脱氢酶(LDH)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)有显著性差异;在HK-2细胞，药物组的新型生物标志物clusterin、CysC、osteopontin、肾损伤因子-1(KIM-1)、谷胱甘肽转移酶π(GSTπ)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)和传统酶学生物标志物LDH、GGT有显著性差异;在RPTEC/TERT1细胞，药物组的新型生物标志物clusterin、CysC、TIMP-1、GSTπ和传统酶学生物标志物LDH、GGT有显著性差异。这些生物标志物有成为肾毒性体外评价检测指标的潜在优势，其灵敏度和特异性还需更多化合物的验证。
　　采用22种化合物（12种肾小管毒性药物，10种非肾小管毒性药物），通过logistic回归和受试者工作特征(ROC)分析，进一步评价HK-2细胞和RPTEC/TERT1细胞中细胞毒性指标细胞存活率(cell viability)、传统酶学生物标志物(GGT、LDH)和新型生物标志物（clusterin、KIM-1、CysC、GSTπ、osteopontin、NGAL、TIMP-1）的预测效能。在HK-2细胞，生物标志物的预测效能依次是KIM-1＞clusterin＞osteopontin＞CysC＞NGAL＞TIMP-1=GSTπ=LDH＞cell viability=GGT; KIM-1、clusterin和osteopontin的联合分析，预测效能相对于单个生物标志物明显提高。在RPTEC/TERT1细胞，生物标志物的预测效能依次是CysC=clusterin＞TIMP-1＞GSTπ＞LDH=GGT＞cell viability; CysC和clusterin的联合分析预测效能比CysC、clusterin高。结果表明，在HK-2细胞和RPTEC/TERT1细胞模型中，新型生物标志物的预测效能明显高于传统的细胞毒性指标和传统酶学生物标志物。
　　最后，采用16种中药单体，进一步验证了HK-2细胞中新型生物标志物KIM-1、osteopontin、clusterin、CysC、TIMP-1、NGAL对中药肾小管毒性的预测效能明显高于传统的细胞毒性指标cell viability。在最佳阈值时，这些新型生物标志物对中药肾小管毒性的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度和特异性明显高于细胞毒性指标。
　　本研究建立的基于新型生物标志物的肾毒性体外替代方法，对肾毒性的预测效能明显高于传统的细胞毒性指标，提高了肾毒性体外评价的灵敏度和靶器官特异性，将有助于新药研发的化合物早期筛选和毒性机制研究。

目录

摘要

缩略词表

前言

第—章肾毒性体外评价模型的建立

第一节 细胞的标准蓝线和生长曲线

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 细胞毒性实验

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第三节 细胞凋亡实验

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

讨论

小结

第二章 体外细胞模型中潜在肾毒性生物标志物的筛选

第—节 MDCKⅡ细胞中潜在肾毒性生物标志物的筛选

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 HK-2细胞中潜在肾毒性生物标志物的筛选

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第三节 RPTEC／TERT1细胞中潜在肾毒性生物标志物的筛选

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

讨论

小结

第三章 生物标志物在体外模型的预测效能及在中药肾毒性体外评价中的研究

第一节 生物标志物在体外模型的预测效能

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 新型生物标志物在中药肾毒性体外评价中的预测效能

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

讨论

小结

结语

参考文献

论文综述 体外模型在药源性肾毒性评价中的研究进展

攻读博士学位期间所获成果

致谢

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