同源重组技术在乙型流感病毒M蛋白重组疫苗中的应用研究

摘要

目的：乙型流感病毒分为Victoria和Yamagata亚型，在不同地区两个谱系交替流行。目前使用的三价流感疫苗只含有一个乙亚型，存在疫苗株与流行株的保护性抗原不完全匹配的情况，本研究在重组表达质粒构建的过程中，使用同源重组技术，达到快速、高效连接基因片段的目的，并对重组质粒进行M蛋白表达、纯化、动物安全性和有效性观察。 方法：通过分析2006年-2016年云南省的乙型流感病毒野毒株的流行病特点，并结合世界卫生组织在北半球推荐使用乙型流感病毒疫苗株的变化趋势和保护性抗原的不同，筛选取4株代表性毒株做为实验毒株。提取病毒RNA基因组，进行RT-PCR，胶回收目的DNA片段后与线性化的载体在37℃同源重组30min。通过转化大肠杆菌筛选阳性克隆，并对阳性质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。纯化表达的M蛋白，进一步免疫动物，并进行免疫动物血清中和抗体测定，模型动物的攻毒试验，豚鼠全身过敏性评价，对本研究制备的乙型流感病毒重组蛋白进行了有效性和安全性的评价与分析。 结果：本研究筛选到4株乙型流感病毒株：Massachusetts/12/2014(By)，Hongta/22/2008(By),Longyang/17/2015(Bv)和Brisbane/08/2011(Bv)。使用同源重组的方法，将线性化克隆载体(pUC57)和不同的插入片段扩增产物（分别来自Bv和By两个谱系的M基因PCR产物进行重组，阳性率达到83.3％，测序后发现质粒碱基没有发生突变或缺失，序列正确。实验小鼠和豚鼠在接受腹腔注射乙型流感M重组蛋白后，精神状态良好，饮食、饮水正常，皮毛光亮，粪便正常。体重呈现稳步上升的趋势。在乙型流感重组蛋白免疫3周后，测定各试验组的抗乙型流感病毒中和抗体效价并进行攻毒试验，试验表明重组疫苗剂量与血清中和抗体和攻毒保护力呈正相关，且对不同亚型的B型病毒能够交叉保护。 结论：本研究使用同源重组技术制备重组表达载体能稳定表达M蛋白，纯化获得的乙型流感病毒重组蛋白具有良好的安全性和免疫原性，能刺激机体产生良好的安全性和交叉免疫保护效力。

目录

摘要

1前言

2材料和方法

2．1实验材料

2．1．1研究对象

2．1．2样品处理

2．1．3实验用细胞

2．1．4实验用鸡胚

2．1．5感受态大肠杆菌Rosetta(DE3)

2．1．6重组表达质粒pUC57

2．1．7实验试剂用品

2．1．8实验动物及用具

2．1．9主要仪器设备

2．1．10序列合成及测定

2．1．11、主要溶液

2．2实验方法

2．2．1实验毒株的筛选与鉴定

2．2．2流行毒株的核酸提取

2．2．3目的基因M的PCR扩增

2．2．4线性化pUC57质粒片段提取

2．2．5同源重组

2．2．6反应产物转化、涂板

2．2．7重组质粒的鉴定(PCR、酶切)

2．2．8重组质粒的测序

2．2．9外源基因的诱导表达

2．2．10诱导表达条件的优化

2．2．11 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)

2．2．12目的蛋白的大量纯化

2．2．13 M蛋白重组疫苗

2．2．14动物免疫

2．2．15统计学方法

3实验结果

3．1流行毒株的筛选

3．2流行毒株M基因PCR扩增产物

3．3 pUC57质粒的鉴定和质粒图谱分析

3．4单克隆的挑选

3．5重组质粒的鉴定

3．6测序重组质粒

3．7 pUC57-M重组质粒重组效率统计分析

3．8 pUC57-M序列比对分析

3．11目的蛋白的纯化

3．13实验小鼠体重的监测

3．14血清交叉中和抗体效价

3．15豚鼠采食量监测

3．16乙型流感病毒重组疫苗的豚鼠致敏试验结果

3．17豚鼠攻毒实验结果

4讨论

4．1筛选得到流行株(乙型流感病毒株)及其分离鉴定

4．2含全长M基因的重组表达质粒的构建及表达

4．3重组乙型流感M蛋白重组疫苗在实验小鼠上的免疫效果评价

4．4乙型流感M蛋白重组疫苗在豚鼠体内的疫苗攻毒保护试验研究

5小结与展望

5．1小结

5．2展望

参考文献

附录

论文综述 流感病毒通用疫苗的研究进展

致谢

研究生简历

声明