食管鳞癌基因组拷贝数改变和多基因热点突变与临床病理因素的相关性研究

摘要

本文从以下几个部分展开论述： 第一部分 浅表食管鳞癌的基因组拷贝数分析及其与转移的相关性 目的:浅表食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是一类预后较好的ESCC。内镜下黏膜切除术(Endoscopic mucosal resection，EMR)因其更安全和更好的保留食管结构，而作为浅表ESCC主要的治疗方式。然而，一部分接受EMR的浅表ESCC患者会因发生转移而导致预后不良，需要进一步接受外科手术治疗等。因此发现能够评估浅表ESCC转移风险的生物标记物是十分重要的。本研究的目的是通过全基因组拷贝数分析，找到能够识别高转移风险的浅表ESCC中拷贝数改变(Copy number alteration, CNA)。 方法:本研究收集了于2004年到2010年期间在中国医学科学院肿瘤医院接受外科手术治疗的T1N0M0期ESCC病例38例。该38例样本中包括19例在术后五年内发生了转移和19例在术后五年内未发生转移的病例。使用Affymetrix OncoScanFFPE基因芯片技术对38例ESCC的样本进行全基因组拷贝数检测。并使用荧光定量PCR验证Oncoscan基因芯片的检测结果的一致性。 结果:1.本研究发现了39个基因CNAs的组合能够识别浅表ESCC的转移风险。使用非监督聚类对该39个基因的CNAs进行聚类，以区分浅表ESCC的预后状态，具有较高的准确性，其中有2个实际发生转移的患者和5个实际未发生转移的患者被误判。该39个基因包括FGF4、MRAS和CHEK1基因等。 2.在全部检测样本中，分析发现了28个显著的重复发生的CNAs，包括16个扩增和12个缺失。其中最显著的分别是11q13.3(FGF4)，3q28(TP63)，14q21.1(FOXA1)，8q24.21(MYC)的扩增和9p21.3(CDKN2A)，22q11.23(GSTT1)，3p13(MITF)，2q22.1（LRP1B）的缺失。 3.在转移组样本中，分析发现了8个显著的重复发生的CNAs，包括4个扩增和4个缺失。在未转移组样本中，分析发现了14个显著的重复发生的CNAs，包括12个扩增和2个缺失。通过转移组与未转移组比较发现，3p26.33(SOX2OT)、8q24.21(MYC)和14q21.1(FOXA1)的扩增以及3p12.1(GBE1)的缺失仅在转移组中发现为重复发生的CNAs。 结论:通过拷贝数分析发现，39个基因CNAs的组合可能可以作为评估浅表ESCC转移风险的工具，除此之外还发现了3p26.33(SOX2OT)、8q24.21(MYC)和14q21.1(FOXA1)的扩增以及3p12.1(GBE1)的缺失浅表ESCC转移可能是驱动事件。 第二部分 靶向测序检测食管鳞癌中44个常见突变基因的热点突变 目的:相对于传统的化疗，癌症的靶向治疗特异性更强。识别癌症的靶向治疗的治疗靶点依赖于对癌症分子机制的了解及分子改变的发现。为了提高对食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的遗传学改变的理解，目前已有多项针对ESCC的全基因组或全外显子组二代测序研究的开展。虽然这些研究已经阐明了ESCC的突变特征及在ESCC发生发展中起重要作用的基因，但是目前能够转化到ESCC临床应用中的基因组合十分有限。本研究的目的是尝试建立用于为ESCC患者提供预测预后及治疗靶点的生物标记物组合。 方法:本研究纳入了从2004年到2009年于中国医学科学院肿瘤医院接受ESCC的外科手术治疗的119例ESCC病例，全部病例均有五年随访资料。根据已经发表的论文及COSMIC(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)数据库，我们初步确立了44个在ESCC中高突变频率的基因组合，包括了细胞周期调控基因、组蛋白修饰物基因和NOTCH信号通路基因等。进一步设计成针对Ion Torrent平台的测序引物。使用Ion Torrent PGM平台对119例ESCC病例的福尔马林固定石蜡包埋的组织进行靶向测序检测。 结果:1.每个样本中平均突变个数是3个（0个-13个）。靶向测序结果中最常见的突变特征是发生在CpG二联核苷酸上的C＞T转换。 2.119例样本中，共发现389个突变，其中包括21个重复发生的突变和255个仅发生了一次的突变。本队列高突变频率的基因依次为TP53基因(54.6％)，其次是KMT2C(40.3％)、NOTCH1(35.3％)、PIK3CA(10.9％)、FAT1(10.1％)、CSMD3(9.24％)、FAT2(9.24％)和KMD2T(9.24％)等。 3.本研究中共检测到了112个致病性或可能致病性的突变，以及160个意义不明的突变。在119例样本中，有14例患者可能可以作为潜在的靶向治疗的受益者。可以作为治疗靶标的重复发生的突变包括EGFR p.L858R(2/119)、 BRCA2 p.R2842H(2/119)、 PIK3CA p.E542K(4/119)、 PIK3CA p.E545K(4/119)和PIK3CA p.H1047R(2/119)。 4.肿瘤的分化程度、KMT2C基因突变和ZNF750基因突变与ESCC的预后显著相关。这三个预后特征被进一步构建了一个预后的线阵图（C指数为0.673）和一个随机生存森林模型(预测错误率为0.3484)，用于预测ESCC预后。 结论:在本研究中，有11.8％(14/119)的ESCC患者可能可以接受靶向治疗的受益者。KMT2C基因突变和ZNF750基因突变是ESCC的预后影响因素。我们尝试初步建立了一个可以为ESCC患者提供预测预后及指导治疗的多基因组合。

目录

中英文缩略词

摘要

第一部分浅表食管鳞癌的基因组拷贝数改变及其与转移的相关性

前言

技术路线

材料与方法

1．病理和临床资料

2．主要试剂

3．主要仪器和设备

4．主要分析软件

5．实验方法与步骤

6．数据分析

结果

1．浅表ESCC患者的临床病理特征

2．38例浅表ESCC的全基因组CNA

3．在转移组和未转移组中的重复发生的拷贝数改变

4．比较转移组与未转移组之间的891个癌症基因的拷贝数改变差异

5．39个拷贝数差异基因的功能富集

6．qPCR的拷贝数验证结果

讨论

第二部分 靶向测序检测食管鳞癌中44个常见突变基因的热点突变

前言

技术路线

材料与方法

1．病理和临床资料

2．主要试剂

3．主要仪器和设备

4．主要分析方法

5．实验流程

6．数据分析

结果

1．119例ESCC患者的临床病理特征

2．靶向测序质控及结果

3．靶向测序的体细胞突变

3．突变基因与临床病理因素之间的相关性

4．突变基因与临床病理特征的预后价值

讨论

参考文献

文献综述 食管鳞状细胞癌的基因组改变及其临床意义

课题资助基金

附录

致谢

个人简历

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