对果蝇肠道干细胞分化时命运抉择机制的研究

摘要

多能的成体干细胞在自我更新时，两个子细胞的其中之一通过分化过程成为各种类型的成熟细胞。尽管已有大量的研究关于子细胞是如何在“维持干性”还是“分化”之间做选择的，目前还不清楚在多能干细胞的体系中，进行分化的子细胞是如何选择分化为哪一种类的细胞，以及不同的品系命运是何时在干细胞中被决定的。 果蝇的肠上皮干细胞是一个研究多能干细胞命运决定的一个相对简单的模型。ISC默认的子细胞命运是具有营养吸收功能的肠上皮细胞(Enterocyte，EC)，而另一类具有分泌功能的内分泌细胞（Enteroendocrine cell，简称EE）的命运是如何决定的尚不清楚。之前的研究证明了果蝇复合基因Acheate-scute complex(As-c)在EE分化过程中的作用[5]，其中的一个基因scute(sc)也被证明对EE命运决定即是充分也是必要的。然而Sc是如何被调控韵及它是如何促进ISC向EE命运决定的，尚不清楚。 在本研究中，我们发现转录因子Sc在果蝇肠上皮干细胞中的瞬时表达决定了干细胞将产生内分泌类型的子细胞，提示转录因子的振荡表达调控了干细胞的命运抉择[6]。研究结果主要有三点: 1)首次分析了ISC产生一对EE的细胞学过程。短暂地过表达Sc迅速引起细胞分裂的反应，同时还诱导了EE特异的转录因子Pros的表达，而Pros却是一个很强的细胞分裂抑制因子。这些特性构成了一个精细调节的环路，指导一对EE细胞经过两次有序的细胞分裂从一个ISC特化而来:ISC先经过一次不对称分裂产生一个EEP，EEP在终末分化前再发生一次细胞分裂，最终形成一对EE细胞。 2)揭示Sc在ISC中的瞬时表达导致了EE命运的决定。Sc-GFP融合蛋白在大部分的ISC中呈现极弱的表达，但在一小部分（约15％）的ISC中有明显的上调和激活;细胞命运追踪实验证明Sc表达水平较高的ISC立即产生的子细胞基本都是EE，而Sc会迅速在ISC中下调，这些ISC因此很快就恢复向肠上皮细胞EC命运分化的默认模式。 3)发现了两个反馈调节环路介导了Sc在ISC向EE分化之前的瞬时表达:一个是Sc基因转录水平的自激活，使得Sc在细胞内逐渐积累直到表达量足以引起EE命运决定的发生;另一个是Sc和enhancer of split complex(E(spl))基因间的负向反馈调节环路，在Sc到达高水平时，被诱导出的E(spl)蛋白会迅速抑制Sc的表达使其还原到默认的低表达模式。 由于反馈调节是介导生化分子周期性震荡的常见机制，比如生物节律的调节等。因此这些反馈调控环路可能介导了Sc在ISC中周期性的上调，作为“生物钟”介导周期性的EE的产生。进一步的细胞和分子水平的分析结合活体成像技术应该能帮助验证这个干细胞命运决定的生物钟调节学说，并探究转录因子的震荡是否以及如何受环境因素的调控。

目录

摘要

引言

1．1．2成体干细胞与微环境

1．1．3干细胞的多能性和分化控制

1．2果蝇肠道作为干细胞研究的进展

1．2．1研究进展概述

1．2．2果蝇中肠的细胞组成与特点

1．2．3成体肠道干细胞的来源与特化

1．2．4各生理状态中各种信号通路对肠道干细胞的调控

1．3果蝇肠道干细胞的品系分化的研究

第二部分实验材料与方法

2．1实验材料与设备

2．1．1实验动物

2．1．2仪器设备

2．1．3抗体与血清

2．1．4材料与试剂

2．1．5测序结果数据分析软件

2．2果蝇的培养和交配条件概括

2．2．1培养果蝇食物

2．2．2杂交与培养环境

2．3遗传操作介绍

2．3．1 Gal4／UAS系统

2．3．2基于FLP／FRT系统的细胞命运追踪

2．3．3抑制型的细胞标记的嵌合体分析(Mosaic analysis with a repressible cell marker，简称MARCM)

2．4实验操作

2．4．1免疫荧光染色

2．4．2成像技术

2．4．3 BrdU标记

2．4．4数据统计与实验重复性

2．5肠干细胞的转录组测序与分析

2．5．1荧光激活细胞分选技术(FACS)

2．5．2 RNA提取

2．5．3 RNA扩增

2．5．4 cDNA文库构建与测序

2．5．5转录组测序结果分析

2．6 DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定(DNA adenine methyltransferase identification，DamID)实验

2．6．1组织样品准备部分

2．6．2 gDNA提取

2．6．4 Dpn Ⅰ限制酶消化

2．6．6连接子介导的(LM)PCR反应

2．6．7 T7核酸外切酶处理

2．6．8 DNA样品打断以及测序分析

第三部分实验结果

3．1EE从头再生分析实验揭示ISC在产生EE前进行了一次自我更新

3．2干细胞中过表达Scute诱导的EE命运决定的过程分析

3．3Scute在ISC中呈现动态表达模式

3．4表达高水平Scute的ISC细胞命运是EE

3．5Notch突变的ISC中Scute表达水平升高，导致过量EE的产生

3．6Scute在ISC中瞬时表达的机制

3．6．1 Sc表达并不受ISC中Slit-Robo2信号影响

3．6．2 Scute与E(spl)基因之间构成一个负反馈调节环路

3．6．3 Scute通过转录水平的自激活实现表达在ISC中的上调

3．7Sc的瞬时激活介导了虫蛹阶段EE细胞的批量产生

第四部分总结与讨论

4．1细胞命运决定蛋白在多能干细胞中瞬时表达

4．2 EEP中Notch信号被抑制的机制

4．4Sc在ISC中实现瞬时性表达的机制

第五部分补充数据列表

参考文献

致谢

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