YTHDF3负向调控Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫应答及其机制研究

摘要

抗病毒天然免疫系统是生物长久进化选择的结果，是抵抗病毒感染的第一道防线。Ⅰ型干扰素(TypeⅠinterferons，IFN-Ⅰ)是脊椎动物对抗急性病毒感染的重要效应分子，分为IFN-α和IFN-β两大类。IFN-Ⅰ通过JAK-STAT信号通路激活上千个干扰素诱导基因(IFN-stimualted genes，ISGs)的转录。宿主产生的ISGs可以通过抑制病毒穿入、扰乱病毒复制以及降解病毒蛋白和核酸等方式来限制病毒生命周期，从而抵抗单股正链RNA((+)ssRNA)病毒、单股负链RNA((-)ssRNA)病毒、双链RNA(dsRNA)病毒和DNA病毒的感染。干扰素应答的失调可能导致抗病毒免疫功能缺陷或自身免疫性疾病。因此，IFN-Ⅰ应答要受到紧密调控，其动态平衡对于机体内环境稳定与抵御外部病原体入侵尤为重要。 IFN-Ⅰ信号通路能通过自分泌环(Autocrine loop)维持自我稳态，而且IFN-Ⅰ信号通路组成分子IFNAR、JAK1、TYK2、STAT1、STAT2和IRF9广泛性地表达在多种细胞中。由于STAT1和IRF9在天然免疫细胞中的组成性本底表达比较高，天然免疫细胞对低剂量的IFN-Ⅰ就能够快速做出应答。抗病毒免疫的效应分子和调控因子受到转录水平、翻译水平以及翻译后水平的调控。机体通过翻译水平调控某些特定基因的表达来迅速适应外界环境应激，这样的调控模式也是宿主抗病毒天然免疫应答调控的理想型模式。宿主通过操控自身的翻译机器来产生更多的抗病毒效应分子。因此，通过选择性翻译调控蛋白表达对于防御病毒感染也是至关重要的。但是，目前对于抗病毒天然免疫在翻译水平调控的研究报道不多，需要更深入地研究。 近年来，随着众多表观酶和表观修饰方式的发现和研究，免疫系统分化发育与功能的表观调控成为生物医学的一个前沿热点课题。目前对于天然免疫应答的表观调控的研究尚刚刚起步，有许多未知领域值得探索。在本课题研究中，发现m6A的读码器YTHDF3通过促进转录抑制因子FOXO3蛋白表达，从而负向调控Ⅰ型干扰素介导的抗病毒天然免疫应答。为了研究YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3是否参与抗病毒天然免疫应答，通过siRNA干扰和CRISPR-Cas9敲除巨噬细胞中YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的表达，发现只有干扰YTHDF3和敲除YTHDF3会显著抑制VSV复制。与此同时，发现YTHDF3缺失可以抑制EMCV和HSV-1复制，表明YTHDF3具有广谱的抗病毒作用，而且病毒感染能抑制YTHDF3的表达，表明YTHDF3可能是一个重要的抗病毒天然免疫反馈调节分子。YTHDF3缺失后，本底ISGs选择性地表达升高;但是当Ⅰ型干扰素受体IFNAR1缺失后，发现干扰YTHDF3和双敲YTHDF3-/-Ifnar1-/-与对照组相比，ISGs的表达和抗病毒能力均没有差异，表明YTHDF3负向调控抗病毒天然免疫依赖于IFNAR1。体内实验表明，YTHDF3-/-小鼠相对于同窝对照野生型小鼠更能抵抗VSV感染。为了研究YTHDF3负向调控抗病毒天然免疫的分子机制，通过增强型紫外交联免疫沉淀联合高通量测序(eCLIP-seq)实验，找到YTHDF3的靶向RNAs。通过生物信息分析，发现YTHDF3能够结合FOXO3(Forkhead box protein O3)mRNA的翻译起始区域。FOXO3是转录抑制分子，能够特异地负向调控抗病毒效应分子的本底表达。YTHDF3缺失能降低FOXO3蛋白表达，而且只有全长的YTHDF3蛋白才能结合FOXO3mRNA和其他靶向RNAs。YTH(YT521-B homology)结构域、缺失YTH结构域的突变体或缺失脯氨酸/甘氨酸/天冬氨酸富集结构域的突变体对于FOXO3mRNA的结合能力都显著下降，而且结合RNA骨架的K422和R533以及形成的疏水口袋特异识别m6A的W438和W492突变成丙氨酸后，同样失去了结合靶向FOXO3的能力。为了研究YTHDF3的分子功能，通过质谱鉴定了YTHDF3相互作用蛋白组，发现YTHDF3结合蛋白翻译起始因子和多种RNA结合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)。通过分析YTHDF3的相互作用蛋白组，推测YTHDF3在翻译水平调控了IFN-Ⅰ介导的抗病毒免疫应答，并且发现PABP1和eIF4G2能够与YTHDF3协同调控FOXO3的翻译。最后，通过在YTHDF3缺失细胞中回补FOXO3的表达，发现其可以逆转缺失YTHDF3抑制病毒复制的作用，从而证明YTHDF3与PABP1和eIF4G2协同促进FOXO3的蛋白翻译，从而负向调控Ⅰ型干扰素介导的抗病毒天然免疫应答。 我们的研究证实YTHDF3通过促进FOXO3蛋白表达来负向调控Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫应答。提出了一个抗病毒天然免疫应答翻译调控的新模式。YTHDF3不仅可以成为用于增强ISGs本底表达来抵抗病毒感染的一个潜在靶点，还可能参与肿瘤和自身免疫性疾病的发生发展，也可能会作为肿瘤和自身免疫性疾病防治的潜在靶点。

目录

摘要

引言

1．1实验材料

1．1．1实验动物

1．1．2细胞系和病原体

1．1．3质粒载体和分子克隆试剂

1．1．4主要试剂和抗体

1．1．5实验仪器和设备

1．2．实验方法

1．2．1 YTHDF3敲除小鼠的培育和鉴定

1．2．2质粒构建

1．2．3小鼠原代细胞获取和培养

1．2．4利用CRISPR-Cas9技术构建YTHDF1-3敲除RAW264．7细胞

1．2．5 RAW264．7过表达细胞系构建

1．2．6细胞siRNA干扰

1．2．7总RNA的提取、cDNA制备和定量PCR

1．2．8蛋白质印迹(Western Blot)检测相关蛋白表达

1．2．9细胞转染

1．2．10免疫共沉淀和质谱兼容的银染

1．2．11流式细胞分析

1．2．12病毒感染

1．2．13 IFN-β测定

1．2．14增强型紫外交联免疫沉淀(eCLIP,enhanced CLIP)

1．2．15 RNA免疫共沉淀(RIP)

1．2．16多聚核糖体分馏分析(Polysome fractionation)

1．2．17免疫荧光

1．2．18实验数据分析

2．1 YTHDF3促进病毒复制

2．1．1 YTHDF家族分子调控VSV复制的筛选

2．1．2 YTHDF3促进VSV复制

2．1．3 YTHDF3广谱地促进病毒复制

2．2 YTHDF3负向调控I型干扰素抗病毒天然免疫应答

2．2．1 YTHDF3负向调控本底ISGs的表达

2．2．2 YTHDF3负向调控本底ISGs的表达不依赖于天然免疫信号活化

2．2．3 YTHDF3负向调控本底ISGs的表达依赖于IFNAR1

2．3 YTHDF3在抗病毒天然免疫应答调控中的体内功能

2．3．1 YTHDF3缺失不影响脾脏中免疫细胞的比例

2．3．2敲除YTHDF3增强天然免疫细胞的抗病毒免疫应答

2．3．3 YTHDF3缺失能够保护小鼠抵抗VSV感染

2．4 YTHDF3负向调控Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫应答的机制

2．4．1 YTHDF3结合RNA的测序数据分析

2．4．2 YTHDF3特异结合FOXO3 mRNA的翻译起始区域

2．4．3 YTHDF3结合RNA依赖于YTH结构域和P／Q／N富集结构域

2．4．4 YTHDF3相互作用蛋白质谱鉴定

2．4．5 YTHDF3通过结合PABP1和eIF4G2协同促进FOXO3翻译

2．4．6 YTHDF3调控ISGs不依赖于mRNA衰变

2．4．7 YTHDF3通过FOXO3特异地调控抗病毒天免疫应答

第三章结论

第四章讨论

参考文献

英文缩略词表

文献综述 翻译调控与天然免疫的研究进展

个人简历及在读期间发表论文

致谢

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