调控骨骼肌干细胞功能的骨骼肌分泌因子的系统筛选

摘要

骨骼肌成体干细胞粘附在骨骼肌纤维上，位于肌纤维膜和基底膜之间。骨骼肌纤维具有不同的代谢类型，是骨骼肌干细胞最直接的微环境(Niche)。已知骨骼肌纤维可以分泌细胞因子(Myokine)调节骨骼肌干细胞的功能。然而，不同代谢类型的骨骼肌纤维是否可以分泌不同的因子、这些差异的分泌因子是否受代谢调控并不清楚。因此，本课题的科学问题是系统筛选对骨骼肌干细胞具有调控功能的骨骼肌代谢调控的分泌因子。 本研究采用胫骨前肌（以酵解型代谢为主）和比目鱼肌（氧化型代谢为主）这两个不同代谢类型肌群，利用RNA-seq结合分泌蛋白数据库，系统筛选受代谢调控的骨骼肌分泌因子。通过RNA-seq数据分析，发现胫骨前肌和比目鱼肌差异表达基因1301个，GO和KEGG的分析表明这些差异表达基因的功能主要富集在骨骼肌收缩、氧化代谢和酵解代谢通路，此结果与这两个肌群的收缩特性、代谢差异及生理功能是一致的。将胫骨前肌和比目鱼肌差异表达的1301个基因与分泌蛋白数据库比对，发现差异表达基因中有86个分泌因子。进一步通过四个代谢调控模型验证了其中24个分泌因子相关基因的表达是受骨骼肌代谢调控的。 同时，本研究采用代谢组学方法，系统分析了胫骨前肌和比目鱼肌差异分泌的代谢小分子。收取胫骨前肌和比目鱼肌的条件培养基，做代谢组分析，检测到68个差异的代谢小分子。通过RNA-seq数据的联合分析，揭示了胫骨前肌和比目鱼肌差异表达的代谢酶调控了这些代谢小分子的水平。 已知外泌体介导多种因子的分泌，为了进一步探讨以上鉴定的骨骼肌代谢调控的分泌因子（蛋白因子和代谢小分子）是否是由外泌体介导的，本研究分别制备了胫骨前肌和比目鱼肌的条件培养基、并从条件培养基中分离了外泌体并处理培养的骨骼肌干细胞。结果表明:骨骼肌组织条件培养基和外泌体显著影响骨骼肌干细胞的增殖与分化。这为进一步从不同代谢类型肌群的外泌体中鉴定对骨骼肌干细胞具有调控功能的分泌因子和代谢小分子奠定了坚实的基础。 总之，本研究系统筛选了一些受骨骼肌代谢调控的分泌因子。下一步工作主要集中于从不同代谢类型肌群的外泌体中进一步鉴定受代谢调控的分泌因子，同时深入探讨本研究已鉴定的分泌因子对骨骼肌干细胞的调控功能及其分子机制。

目录

摘要

一、骨骼肌成体干细胞

1．1骨骼肌成体干细胞的发现

1．2骨骼肌成体干细胞的标记基因

1．3骨骼肌成体干细胞的起源

二、骨骼肌的分泌功能

2．1骨骼肌以内分泌形式对其他器官的调控

2．2骨骼肌以自分泌／旁分泌形式对自身和骨骼肌干细胞的调控

三、骨骼肌与外泌体

3．1外泌体概述

3．2外泌体以内分泌形式介导组织与组织间的物质和信息交流

3．3外泌体以自分泌／旁分泌形式调控自身和邻近细胞的功能

3．4外泌体在骨骼肌中研究现状

四、骨骼肌纤维作为骨骼肌干细胞的微环境调控其功能

4．1骨骼肌纤维的类型

4．2骨骼肌纤维对骨骼肌干细胞的调控

五、本文的科学问题及研究内容

一、实验材料

1．1实验动物

1．2细胞

1．3主要仪器及设备

1．4引物

1．5主要试剂

二、实验方法

2．1组织(细胞)总RNA的提取

2．2 Oligo引物的反转录体系

2．3 PCR反应

2．4组织(细胞)总蛋白提取

2．5 Western blot

2．6细胞培养

2．7免疫荧光检测

2．8利用流式分选技术分离骨骼肌干细胞

2．9鼠跑步实验

2．10 CCK-8检测细胞增殖

2．11 条件培养基(conditional medium，CM)的制备

2．12 外泌体的分离和鉴定

2．13 代谢组学

2．15 差异候选代谢物的聚类和可视化分析

2．16 RNA-seq测序

实验结果

1．1采用RNA-seq技术系统分析不同代谢类型肌群的基因表达谱差异

1．2 GO和KEGG分析表明TA和Sol肌群具有显著差异的代谢通路

1．3 RNA-seq与分泌蛋白数据库联合分析鉴定(TA和Sol)差异的分泌因子

1．4通过几个代谢模型验证TA和Sol差异的分泌因子是受骨骼肌代谢调控的

二、采用代谢组学系统展示不同代谢类型肌群差异分泌的代谢小分子

2．1 TA和Sol骨骼肌组织条件培养基制备

2．2 TA和Sol骨骼肌组织条件培养基的代谢组学分析及其差异代谢小分子

2．3代谢组学与RNA-seq数据联合分析表明代谢小分子差异存在的原因

三、骨骼肌代谢调控的分泌因子(生长因子和代谢小分子)是否由外泌体介导分泌及其对骨骼肌干细胞的调控功能研究

3．1不同代谢类型肌群来源的条件培养基差异调控骨骼肌干细胞增殖与分化

3．2骨骼肌组织来源的外泌体的分离鉴定

3．3骨骼肌来源的外泌体差异调控骨骼肌干细胞增殖与分化

3．4通过蛋白质谱和代谢组学鉴定不同代谢类型肌群的外泌体成分

讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历

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