长链非编码RNAs对结直肠癌、宫颈癌的诊断及功能研究

摘要

中国癌症的发病率和死亡率近年来均保持上升趋势。越来越多的研究发现，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在多种组织的癌变、侵袭和转移过程中发挥重要功能，扮演着肿瘤抑制基因或致癌基因的角色。 近年来随着细胞分子生物学的飞速发展，研究发现许多长链非编码RNAs广泛参与肿瘤的发生发展和化疗耐药等过程。LncRNAs是长度大于200个核苷酸的非编码RNAs(ncRNAs)。LncRNAs在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调节等方面发挥重要作用。LncRNAs作为能够直接影响细胞信号传导、细胞增殖分化的基因，在许多生物学过程中起重要的调控作用。对于此类新兴分子标记的研究不仅能使对于肿瘤的了解更近一步，甚至还有希望使之成为肿瘤诊断的生物学标记和治疗的细胞内靶点。鉴于lncRNAs在肿瘤临床诊断和治疗方面具有广阔的前景，以lncRNAs为靶点开发抗肿瘤新药必将成为未来抗肿瘤药物研发的新趋势。 首先通过文献筛选出的lncRNAs，采用RT-qPCR技术，并将CCAT2、LINC00511、LINC01133分别在正常人和结直肠癌患者血清组中进行验证，并应用ROC方法分析其诊断效率，结果显示，由CCAT2、LINC00511、LINC01133、CEA与CA19-9联合组成的CRC诊断模型的诊断效率较高，AUC值可达到为0.911。 将以上三种lncRNAs在正常人和宫颈癌患者血清组中进行验证，应用ROC方法分析其诊断效率，结果显示，由CCAT2、LINC00511、LINC01133联合组成的宫颈癌诊断模型的诊断效率较高，AUC值可达到为0.895。CCAT2与LINC01133可联合诊断宫颈上皮样瘤变，AUC值可达到为0.894。 在本研究中，检测了LINC00673在宫颈癌患者、宫颈上皮样瘤变患者与正常对照者血清中的含量，发现LINC00673在癌症组中比正常对照组表达明显升高。利用慢病毒转染在体外构建过表达LINC00673的细胞系并证实:过表达LINC00673显著增加HeLa细胞的体外增殖能力，克隆形成能力。RT-qPCR检测显示过表达LINC00673的HeLa细胞中，IL-10和IL-17A的表达显著增加。裸鼠皮下成瘤实验证实LINC00673在体内对宫颈癌的肿瘤形成有促进作用。Western blot表明，LINC00673通过调控AKT通路进而调节宫颈癌。 检测了SLC25A25-AS1在宫颈癌患者与正常对照者血清中的含量，发现SLC25A25-AS1在癌症组中比正常对照组表达明显降低。表型研究结果显示，在SLC25A25-AS1高表达的宫颈癌HeLa细胞系中，其细胞增殖、克隆形成能力、迁移与侵袭能力受到明显的抑制。SLC25A25-AS1在HeLa细胞中与IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、VEGF和Hsp90α呈负相关性。药物敏感试验显示过表达SLC25A25-AS1的HeLa细胞对化疗药物杀伤的敏感度增加。裸鼠皮下成瘤实验证实SLC25A25-AS1在体内对宫颈癌的肿瘤形成有抑制作用。信号通路活化情况检测发现过表达SLC25A25-AS1则能促进p53和p21的活化。 综上所述，我们的研究提示lncRNAs在癌症的发生发展过程中具有重要作用。其中LINC00673的上调表达可能与宫颈癌肿瘤组织的异常增殖有关;SLC25A25-AS1可能对宫颈癌的发生发展有一定的抑制作用。

目录

图索引

表索引

中英文缩略词

摘要

第一部分长链非编码RNAs作为结直肠癌候选肿瘤标志物的诊断价值研究

前言

一、主要仪器

二、主要试剂及耗材

三、实验方法

一、候选LncRNAs的确定

二、研究对象的临床资料

三、候选长链非编码RNAs在正常对照组和结直肠癌患者中的表达差异

四、3种长链非编码RNAs作为结直肠癌血清标志物的ROC分析

五、血清长链非编码RNAs与结直肠癌临床特征的相关性分析

讨论

第二部分LncRNAs作为宫颈癌候选肿瘤标志物的诊断价值研究

前言

材料与方法

一、研究对象的临床资料

二、候选长链非编码RNAs在宫颈癌患者和正常对照组中的表达差异

三、3种长链非编码RNAs作为宫颈癌血清标志物的ROC分析

四、血清长链非编码RNAs诊断模型与宫颈癌临床特征的相关性分析

五、正常对照、宫颈上皮样瘤变与宫颈癌患者血清之间的差异性表达

六、2种长链非编码RNAs对宫颈上皮样瘤变的ROC分析

七、2种长链非编码RNAs对宫颈上皮样瘤变与宫颈癌的ROC分析

讨论

第三部分LINC00673在宫颈癌中的功能研究

前言

实验材料

三、主要试剂

四、主要仪器

五、计算机分析软件

六、主要溶液的配制

二、细胞总RNA的提取

三、eDNA合成

四、实时定量PCR分析

五、细胞系及其培养

六、感受态细菌的制备

七、感受态细菌的转化

八、质粒中提

九、慢病毒表达载体pLVX-Puro LINC00673构建

十、慢病毒制备及稳转细胞系的构建

十一、MTT法测定细胞生长曲线

十二、平板克隆形成实验

十三、流式检测细胞周期实验

十四、细胞迁移实验

十五、细胞侵袭实验

十六、裸鼠皮下成瘤实验

十七、Western blot

十八、统计方法

实验结果

一、LINC00673在宫颈癌患者及宫颈上皮样瘤变患者血清中表达升高

二、LINC00673过表达稳转细胞系建立

三、LINC00673对宫颈癌细胞恶性表型的影响

四、顺铂处理后的HeLa细胞中LINC00673表达变化

五、过表达LINC00673对富颈癌细胞顺铂化疗耐受情况的影响

六、过表达LINC00673促进HeLa细胞在裸鼠体内的成瘤能力

七、与LINC00673表达相关的信号通路检测

讨论

第四部分SLC25A25．ASl在宫颈癌中的功能研究

前言

材料与方法

实验结果

一、SLC25A25-AS1在宫颈癌患者及宫颈上皮样瘤变患者血清中表达降低

二、SLC25A25-AS1对宫颈癌细胞系恶性表型的影响

三、顺铂处理后的HeLa细胞中SLC25A25-AS1表达变化

四、过表达SLC25A25-AS1对宫颈癌细胞顺铂化疗耐受情况的影响

五、过表达SLC25A25-AS1抑制HeLa的迁移能力

六、过表达SLC25A25-AS1抑制HeLa的侵袭能力

七、过表达SLC25A25-AS1抑制HeLa在裸鼠体内的成瘤能力

八、与SLC25A25-AS1相关的信号通路

讨论

参考文献

文献综述 LncRNAs在宫颈癌中的研究进展

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