靶向TGF--β1主动免疫调控肿瘤微环境以及核酸与纳米材料佐剂对治疗性HPV疫苗作用的影响

摘要

宫颈癌是严重危害女性健康的疾病之一，而人乳头瘤病毒(HPV)的感染是导致宫颈癌的主要因素。虽然目前已经有三种预防性HPV疫苗批准上市，能够保护约90％的HPV感染引起的宫颈癌，但其对已经建立的HPV持续感染、癌前病变及癌症并没有治疗效果。因此，研发有效的治疗性HPV疫苗对于临床治疗HPV相关肿瘤具有重要意义。 转化生长因子-β1(TGF-β1)是肿瘤微环境中关键的免疫抑制分子，其能够诱导初始T细胞分化为调节性T细胞(Treg)，分化的Treg细胞通过多种机制显著抑制效应T细胞分化、增殖及功能。TGF-β1促进骨髓来源免疫抑制细胞(MDSCs)分化、增殖及向肿瘤迁移。此外，TGF-β1也可促肿瘤细胞增殖、促肿瘤血管生成、刺激细胞外基质表达等促进肿瘤的生长与转移。除了Treg细胞，肿瘤微环境中的免疫抑制细胞MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞、以及成纤维细胞等都能够表达TGF-β1。因此，靶向TGF-β1进行干预，具有拮抗肿瘤免疫抑制微环境，促进抗肿瘤免疫的潜力。 Toll-样受体(TLR)3/9以及STING激动剂cGAMP显示了强效的诱导Th1/CTLs偏向的细胞免疫应答的能力，是有潜力的肿瘤疫苗佐剂;而纳米材料有助于抗原被DCs高效摄取、加工以及抗原向淋巴结迁移提高DCs激活效率，此外，纳米材料可提高抗原与核酸免疫刺激物的体内稳定性并促进两者向DCs的同时递送，利于高效激活免疫应答。因此，核酸佐剂与纳米材料的联合应用，具有诱导强的肿瘤抗原特异细胞免疫的潜力。 目前肿瘤疫苗面临巨大挑战其中重要的原因是肿瘤抑制微环境对Th1/CTLs的抑制以及疫苗未诱导强的Th1/CTLs应答，因此本研究拟通过抗细胞因子主动免疫靶向调控TGF-β1以拮抗肿瘤免疫抑制微环境，以及应用新型核酸与纳米材料佐剂以刺激抗肿瘤免疫这两个方面，探讨提高治疗性疫苗抗肿瘤作用的有效策略。 在靶向TGF-β1的研究中，基因重组获得的呈现了TGF-β1抗原肽的乙肝核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒(VLPs)经预防性策略免疫小鼠，激发TGF-β1特异的抗体应答，然后皮下接种TC-1肿瘤细胞，当肿瘤长至5-6mm大小时，以治疗性策略进行携带了HPV16E7肽的HBcAg VLPs治疗性HPV疫苗的免疫干预。肿瘤大小监测显示，抗TGF-β1主动免疫显著增强了治疗性HPV疫苗接种对肿瘤生长的抑制;ELISA表明IgG1/IgG2a的比例显著降低，IFN-γ水平升高而IL-4降低，提示Th1应答获得增强;ELISPOT结果表明，分泌IFN-γ的淋巴细胞水平显著提高，相应地，流式分析显示小鼠CD4+IFN-γ+与CD8+IFN-γ+效应细胞数目显著增加，而CD4+Foxp3+Treg细胞数目显著降低;同时，肿瘤组织血管生成及VEGF基因水平表达受到显著抑制;此外，Real time PCR检测表明IFN-γ、TNF-α及效应T细胞趋化因子CCL19基因表达水平上调，而MDSCs细胞趋化因子CXCL1基因水平下调;进一步的检测证实，TGF-β1信号通路激活关键分子pSmad3的水平降低。 在核酸与纳米材料佐剂研究中，阳离子脂质体DOTAP联合核酸佐剂CpG、PolyI∶C和cGAMP显著促进了治疗性VLPs疫苗激发的肿瘤生长抑制作用，提高了分泌IFN-γ的淋巴细胞、CD8+IFN-γ+、CD8+CD107a+、CD4+IFN-γ+效应T细胞、以及CD8+CD44+、CD4+CD44+免疫记忆T细胞水平，降低了免疫抑制的CD4+Foxp3+Treg细胞与CD11b+Gr-1+MDSCs水平。进一步以PLGA/DC-chol/HA新型纳米颗粒作为E7肽表位及核酸刺激物的递送载体，获得了类似的结果。体外实验显示，纳米颗粒与核酸佐剂尤其核酸佐剂联合应用有效增强了BMDC表面成熟标记CD40、CD80、CD83、CD86、MHC-Ⅰ分子的表达，同时，促进细胞因子TNF-α、IL-2和IL-12的分泌;在小鼠体内实验中，以预防性策略和治疗性策略免疫接种，纳米颗粒联合核酸佐剂尤其核酸佐剂组合显著抑制了小鼠肿瘤的生长，具有增强的CD8+IFN-γ+、CD8+CD107a+、CD4+IFN-γ+、CD8+CD44+、CD4+CD44+T细胞水平，以及降低的CD11b+Gr-1+MDSCs细胞水平，提示有效激发了CTLs/Th1偏向的抗肿瘤免疫应答。 本研究结果强烈提示，抗细胞因子主动免疫靶向调控TGF-β1以及纳米材料联合核酸佐剂尤其是佐剂组合，显著增强了治疗性HPV疫苗激发的抗肿瘤效力与免疫应答，是有潜力的联合免疫策略，为治疗性肿瘤疫苗的研发提供了新的思路。

目录

摘要

前言

一、HPV的生物学特征及致病机制

二、HPV治疗性疫苗研究现状

三、肿瘤微环境的作用机制

四、TGF-β在肿瘤中的重要作用

五、抗细胞因子主动免疫策略的应用前景

六、新型佐剂在提高疫苗作用中的影响

七、纳米颗粒靶向递送抗原在肿瘤治疗中的重要作用

八、研究目的及意义

第一部分靶向TGF-β1主动免疫对HPV16病毒样颗粒治疗性疫苗作用的影响

1引言

2实验材料与方法

2．1实验材料

2．2实验方法

3结果与分析

3．2重组蛋白的纯化

3．3病毒样颗粒的鉴定

3．4 TGF β1 VLPs联合免疫HPV16治疗性疫苗对小鼠肿瘤模型的干预研究

4．讨论

4．1疫苗联合疗法是有效的肿瘤干预新手段

4．3应用VLP作为载体利于打破自身蛋白的免疫耐受

4．4靶向TGF-β1并联合VLPs治疗性疫苗对小鼠肿瘤干预潜能

4．5联合免疫TGF-β1 VLPs和VLPs治疗性疫苗诱导的免疫效应评价

4．6联合免疫对肿瘤血管、相关趋化因子的影响

4．7靶向TGF-β的作用机制初步评价

5．小结

第二部分核酸免疫刺激物及纳米颗粒佐剂对HPV16 E7抗原激发的抗肿瘤免疫应答的影响

1．引言

2．实验材料与方法

2．1实验材料

2．2实验方法

3．实验结果

3．1 CpG、Poly I：C的协同作用对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响

3．2 DOTAP阳离子脂质体递送核酸佐剂对HBcAg-E749-57 VLPs抗肿瘤作用的影响

3．3新型纳米颗粒靶向递送核酸佐剂对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响

4．讨论

4．1核酸佐剂对免疫系统的影响

4．2树突状细胞对抗肿瘤免疫应答的影响

4．3核酸佐剂协同作用以及纳米颗粒递送系统的应用对治疗性疫苗的抗肿瘤干预潜能的影响

4．4核酸佐剂协同作用以及纳米颗粒递送系统的应用对抗肿瘤免疫应答的影响

5．小结

5．3纳米材料靶向递送核酸佐剂对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响

展望

参考文献

附录

致谢

个人简历

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