利用安全选择标记系统进行枫香耐盐转基因研究

摘要

土壤盐渍化是一个世界性问题。在盐碱地上植树造林不仅可以改善生态环境，而且可以带来一定的经济效益，因此，耐盐树种的选育是林木育种工作者的当务之急。基因工程技术打破了常规育种的局限性，可直接将外源耐盐基因导入林木从而获得耐盐新品种，加速育种进程。但转基因植株中选择标记基因安全性已引发了广泛的争议。本研究运用了双效安全的选择系统对枫香进行耐盐转化，主要取得了以下三个方面的实验结果： (1)构建了双T-DNA表达载体pCAMBI1301-NHX。 本实验成功构建了含manA和AtNHX1基因的双T-DNA表达载体pCAMBI1301-NHX。这是首次将耐盐基因和甘露糖安全选择标记基因构建到同一个植物表达载体上，并且这两个基因分别位于载体的两个独立的T-DNA区，通过农杆菌介导植物转化该表达载体，可以获得含安全选择标记基因的T<,0>代转化植株，选择标记基因和目的基因可以在转基因植株自交后代中分离，期望在T<,1>代筛选到只含有AtNHX1基因的MFTP。 (2) 首次建立了枫香甘露糖筛选体系。 通过甘露糖敏感性测验结果发现，随甘露糖浓度增加，枫香不定芽分化率降低，说明枫香可以利用甘露糖对转基因植株进行筛选；受体叶片与农杆菌共培养后，在含不同浓度的甘露糖和蔗糖的分化培养基上进行分化，不定芽经PCR检测结果显示，在含15g/l甘露糖和10g/l蔗糖的培养基上分化的不定芽阳性率为82±15.7％，每个分化叶片平均可诱导出7.7±3.8 个阳性芽，转化效率最高，因此确定该浓度组合为枫香甘露糖筛选体系的选择压。 (3)利用甘露糖筛选体系转化获得一批转基因枫香植株。 以枫香叶片为受体材料，通过根癌农杆菌介导转化和甘露糖筛选，获得的转化植株经PCR和CPR检测，共有134株阳性植株，部分苗已移栽成活；部分植株的PCR-Southern和RT-PCR检测结果显示，AtNHX1基因已整合到枫香基因组DNA中，并且能在转基因枫香体中表达。

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第一章绪论

1.1植物耐盐性研究

1.1.1植物的盐害

1.1.2植物耐盐机制

1.1.3 Na+/H+逆向转运蛋白的研究进展

1.1.4林木耐盐基因工程研究进展

1.2植物遗传转化的选择标记

1.2.1负向筛选体系

1.2.2正向筛选体系

1.2.3选择标记基因的安全性研究

1.3研究目标和主要研究内容

1.3.1研究目标

1.3.2主要研究内容

1.4技术路线

第二章含manA的双T-DNA植物表达载体构建

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1中间载体pBSmanA的构建

2.2.2中间载体pBS130的构建

2.2.3中间载体pCAMBIA1301-manA的构建

2.2.4双T-DNA表达载体pCAMBI1301-NHX的构建

2.2.5表达载体pCAMBI1 301-NHX的农杆菌转化

2.3讨论

2.3.1灵活解决载体构建过程中的常见问题

2.3.2构建安全的植物表达载体

2.4小结

第三章甘露糖筛选体系的建立

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1枫香不定芽分化对甘露糖敏感性分析

3.2.2甘露糖选择压力的筛选

3.2.3 PCR检测

3.3讨论

3.3.1甘露糖筛选体系的优点

3.3.2甘露糖筛选体系的影响因素

3.4小结

第四章农杆菌介导枫香耐盐转化及再生植株的检测

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1枫香实生苗的耐盐性

4.2.2转化植株的再生

4.2.3转基因植株的分析鉴定

4.3讨论

4.3.1枫香耐盐转基因的意义

4.3.2提高基因转化效率

4.3.3转化植株再生

4.3.4转基因植株的检测

4.4小结

第五章结论与下一步工作计划

5.1主要结论

5.2下一步工作计划

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢