不同鼠类宿主对伯氏疟原虫易感性的研究

摘要

目的：建立不同鼠类宿主易感性的实验动物模型，观察不同鼠类宿主易感性的差异，探讨造成鼠类宿主易感性差异的机制。
　　方法：(1)昆明小鼠、BALB/c小鼠、SD大鼠分为正常对照组和感染第1、3、5、7、9天组，感染组分别腹腔注射1×106个P.b（SD大鼠注射1×107个P.b），每组10只。(2)记录不同鼠类宿主的原虫血率、生存率以及脾脏湿重。(3)流式细胞术检测正常对照组和感染组外周血CD4+、CD8+、NK、NKT细胞比例变化。(4) ELISA法检测正常对照组和感染组外周血ARG、IFN-γ、IL-4含量的变化。(5)使用NO、NOS合酶检测试剂盒检测正常对照组和感染组外周血NO、NOS合酶含量的变化。(6)实时荧光定量 PCR法检测正常对照组和感染组外周血 TLR4、TLR9相对表达的变化。
　　结果：
　　1.昆明小鼠组和BALB/c小鼠组在感染P.b后原虫血率逐渐升高，最后全部死亡，而SD大鼠组在感染P.b第5天达到高峰，随后原虫血症逐渐消失。
　　3种鼠类宿主分别与其正常对照组比较，昆明小鼠感染第1、3、5、7、9天组脾脏重量显著大于正常对照组（P<0.01）；BALB/c小鼠感染第1天组无统计学差异，感染第3、5、7、9天组脾脏重量显著大于正常对照组（P<0.01）；SD大鼠感染第1天组无统计学差异，感染第3、5、7、9天组脾脏重量大于正常对照组（P<0.05）。
　　2.昆明小鼠外周血 CD4+、CD8+T淋巴细胞比例与正常对照组比较，感染P.b第1、3、5天外周血CD4+T淋巴细胞比例升高（P<0.05），感染第7天外周血CD4+T淋巴细胞比例降低（P<0.05），感染第9天无统计学差异；感染P.b第1、3、5外周血CD8+T淋巴细胞比例降低（P<0.05），感染第7天CD8+T淋巴细胞比例升高（P<0.05），感染第9天无统计学差异。
　　BALB/c小鼠外周血 CD4+、CD8+T淋巴细胞比例与正常对照组比较，感染P.b第1、3天CD4+T淋巴细胞比例升高（P<0.05），感染第7天CD4+T淋巴细胞比例降低（P<0.05），感染第5、9天外周血CD4+T淋巴细胞比例无统计学差异；感染P.b第1、3天CD8+T淋巴细胞比例降低（P<0.05），感染第7天CD8+T淋巴细胞比例升高（P<0.05），感染第5、9天无统计学差异。
　　SD大鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例与正常对照组比较，感染P.b第1天外周血CD4+T淋巴细胞比例升高（P<0.05），感染P.b第3、5、7、9天外周血CD4+T淋巴细胞无统计学差，感染P.b第1天外周血CD8+T淋巴细胞比例降低（P<0.05），感染P.b第3、5、7、9天外周血CD8+T淋巴细胞比例无统计学差异。
　　3.昆明小鼠外周血NK、NKT细胞比例与正常对照组比较，感染P.b第1、3、5天外周血NK细胞比例升高（P<0.05），第7天无统计学差异，第9天外周血NK细胞比例降低（P<0.05）；感染P.b第1、5天外周血NKT细胞比例无统计学差异，第3天外周血NKT细胞比例升高（P<0.05），第7、9天外周血NKT细胞比例显著降低（P<0.01）。
　　BALB/c小鼠外周血NK、NKT细胞比例与正常对照组比较，感染P.b第1、7天外周血 NK细胞比例无统计学差异，第3、5天外周血 NK细胞比例升高（P<0.05），第9天外周血NK细胞比例显著降低（P<0.01）；感染P.b第1天外周血NKT细胞比例无统计学差异，第3天外周血NKT细胞比例升高（P<0.05），第5,7,9天外周血NKT细胞比例降低（P<0.05）.
　　SD大鼠外周血NK、NKT细胞比例与正常对照组比较，感染P.b第1天外周血NK细胞比例升高（P<0.05），第3天外周血NK细胞比例显著升高（P<0.01），第5、7天外周血NK细胞比例升高（P<0.05），第9天外周血NK细胞比例无统计学差异；感染第1天外周血NKT细胞比例升高（P<0.05），第3、5、7、9天外周血NKT细胞比例均显著升高（P<0.01）。
　　4.昆明小鼠组NO、NOS、Arginase值与正常对照组比较，感染P.b第1天血清NO值显著升高（P<0.01），第3、5天无统计学差异，第7、9天血清NO值降低（P<0.05）；感染P.b第1、3、5、7、9天血清NOS无统计学差异；感染P.b第1天血清Arginase值降低（P<0.05），第3、5、7、9天血清Arginase值无统计学差异。
　　BALB/c小鼠组NO、NOS、Arginase值与正常对照组比较，感染P.b第1天血清NO值显著升高（P<0.01），第3、5天血清NO值无统计学差异，第7、9天血清NO值降低（P<0.05）；感染P.b第1、3、5、7、9天血清NOS值无统计学差异；感染P.b第1、3天血清Arginase值降低（P<0.05），第5、7、9天血清Arginase值无统计学差异。
　　SD大鼠组NO、NOS、Arginase值与正常对照组比较，感染P.b第1、3、5、7、9天血清NO值显著升高（P<0.01）；感染P.b第1、3、5、7、9天血清NOS无统计学差异；感染P.b第1、3、5、7、9天血清Arginase值均降低（P<0.05）。
　　5.昆明小鼠组血清IFN-γ、IL-4相对表达值与正常对照组比较，感染P.b第1、3、5天血清IFN-γ值升高（P<0.05），第7、9天血清INF-γ值无统计学差异；感染P.b第1天血清 IL-4值无统计学差异，第3、5、7、9天血清IL-4值升高（P<0.05）。
　　BALB/c小鼠组血清 IFN-γ、IL-4与正常对照组比较，感染 P.b第1、3、5天血清IFN-γ值升高（P<0.05），第7、9天血清IFN-γ值无统计学差异；感染P.b第1天血清IL-4值无统计学差异，第3、5、7、9天血清IL-4值显著升高（P<0.01）。
　　SD大鼠组血清IFN-γ、IL-4与正常对照组比较，感染P.b第1、3、5、7天血清IFN-γ升高（P<0.05），第9天血清IFN-γ无统计学差异；感染P.b第1、3天血清IL-4无统计学差异，第5、7、9天血清IL-4值升高（P<0.05）。
　　6. BALB/c小鼠TLR4、TL9相对表达值与正常对照组比较，感染P.b第1、3、5、7天 TLR4相对表达显著升高（P<0.01），第9天 TLR9相对表达下降（P<0.05）；感染P.b第1、3天TLR9相对表达无统计学差异，第5天TLR9相对表达显著升高（P<0.01），第7天TLR9相对表达下降（P<0.05），第9天TLR9相对表达显著下降（P<0.01）。
　　SD大鼠TLR4、TLR9相对表达值与正常对照组比较，感染P.b第1、3、5、7天TLR4相对表达显著升高（P<0.01），感染P.b第9天TLR4相对表达无统计学差异；感染P.b第1、3、5、7、9天TLR9相对表达均显著升高（P<0.01）。结论:
　　(1)本实验证实不同鼠类宿主存在易感性差异的现象，昆明小鼠和 BALB/c小鼠无法控制感染而最终死亡，SD大鼠能有效清除疟原虫且最终自愈。(2)早期IFN-γ大量的表达以及CD4+T淋巴细胞的比例上升提示Th1类免疫应答反应在抗疟原虫感染过程中起重要作用。(3)昆明小鼠和 BALB/c小鼠的 NK、NKT细胞比例先升高后降低，而SD大鼠NK细胞比例升高后维持稳定，NKT细胞比例持续升高，提示大鼠的NK、NKT细胞在清除疟原虫过程中起到重要作用，这也许是造成其易感性差异的原因之一(4)昆明小鼠和BALB/c小鼠NO值先升高后降低，而SD大鼠NO值持续升高，提示大鼠的NO在清除疟原虫中起到作用。(5) BALB/c小鼠TLR4和TLR9相对表达先升高后降低，而SD大鼠TLR4相对表达升高后降低，TLR9相对表达持续升高，提示TLR9相对表达的差异可能是造成疟原虫易感性差异的原因之一。

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引言

材料与方法

1. 实验材料

2. 实验方法与步骤

3 统计学分析

结果

1鼠类宿主感染P. berghei-ANKA后原虫血率的变化

2鼠类宿主感染P. berghei-ANKA后的存活率

3鼠类宿主感染P.b后脾脏重量

4 P. b对鼠类宿主T细胞亚群以及NK细胞影响

5 昆明小鼠、BALB/c小鼠和SD大鼠感染P.b后血清NO、NOS合酶和ARG含量的变化

6 昆明小鼠、BALB/c小鼠和SD大鼠感染P.b后血清IFN-γ和IL-4含量的变化

7 BALB/c小鼠和SD大鼠感染P.b后外周血实时荧光定量PCR法检测TLR4、TLR9相对表达变化

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A英文缩略词表

附录B常用试剂配制

附录C

附录D宿主对疟原虫易感性的研究进展