尾赤桉再生体系及农杆菌介导的转基因体系研究

摘要

本文以尾赤桉无性系DH201-2的叶片和茎段为外植体建立了高效的再生体系，并初步建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系，获得了 km抗性植株，研究结果为今后的桉树转基因技术、转基因育种和功能基因组学研究奠定了基础。主要研究结果如下：
　　1．通过对外植体的筛选、激素种类和浓度的调整、培养条件的选择，取自生根培养基上培养30天植株的上部和中部的茎段在mMS+TDZ0.05mg.L-1+NAA0.50 mg.L-1的培养基中获得高达57.0％的植株再生；取在生根培养基上培养20天的植株，顶端起第2～4片叶片在mMS+TDZ0.05 mg.L-1+IBA0.1 mg.L-1的培养基中获得48.3%的植株再生；适合于茎段和叶片不定芽分化的Ca(NO3)2浓度为0.706 g.L-1。
　　2．尾赤桉无性系 DH201-2对卡那霉素具有一定的本底抗性，叶片外植体的卡那霉素抗性达到90mg.L-1;茎段外植体的浓度在120mg.L-1，植株达到更高的水平150mg.L-1。
　　3．当培养基中的头孢霉素达到300mg.L-1时，叶片和茎段仍然保持很高的再生率，且再生植株的形态良好，且能够很好的杀死和清除农杆菌，经过3次每次各15天的培养后极少有农杆菌生长。
　　4．GV3101，EHA105，LBA4404和C58C1四种农杆菌菌株的转化效率比较发现，菌株GV3101对尾赤桉无性系DH201-2的转化效率最高，叶片外植体的gus瞬间表达率达到30%，茎段外植体达到70%。
　　5．经过预培养6天的茎段外植体在农杆菌光密度OD600为0.4～0.5的菌液中浸泡30mins，然后转移到pH值5.6的共培养培养基中共培养4天，达到最高的转化效率；经过预培养3天的叶片，在光密度OD600为0.4～0.5的农杆菌菌液中浸泡30mins，然后转移到pH值5.6的培养基中共培养3天，达到最高的转化效率。
　　6．茎段外植体转化中在农杆菌菌液中和共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮转化效果最好；叶片外植体转化研究中，在共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮转化效果最好。
　　7．茎段具有较高的转化效率，平均转化效率大于50%，最高达到70%；而叶片外植体的转化率偏低，平均转化效率约30%，最高也只有47%。201-2的茎段作为外植体更适于转基因研究。

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表目录

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第一章 绪 论

1.1引言

1.1.1研究背景

1.1.2研究目的和意义

1.1.3项目来源与经费支持

1.2桉树转基因国内外研究现状与评述

1.2.1桉树再生体系的建立

1.2.2 桉树转基因方法

1.2.3转化植株筛选与检测

1.2.4研究评述

1.3研究目标和主要研究内容

1.3.1研究目标

1.3.2主要研究内容

1.4研究技术路线

第二章 研究材料与方法

2.1再生研究的材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2试剂

2.1.3试验方法

2.2转化体系研究的材料与方法

2.2.1试验材料

2.2.2试剂

2.2.3试验方法

2.3 试验观测与统计分析

2.3.1再生体系研究的试验观测和统计分析

2.3.2 遗传转化体系的试验观测与统计分析

2.3.3 数据分析和统计模型

第三章 结果与分析

3.1再生体系建立的研究

3.1.1激素对再生的影响

3.1.2大量元素的影响

3.1.3外植体生理年龄的影响

3.1.4 外植体部位对再生影响

3.1.5增殖与生根

3.1.6小结

3.2遗传转化体系建立的研究

3.2.1 Km筛选浓度的确定

3.2.2 Cef对植株再生影响

3.2.3转化程序的优化

3.2.4筛选培养

3.2.5小结

第四章 结论与讨论

4.1结论

4.2讨论

4.2.1再生体系建立

4.2.2转化体系的优化

参考文献

附录一

附 录 二

在读期间的学术研究

致谢