植物栓塞修复机制与质膜内在水通道蛋白基因的克隆、表达和转基因研究

摘要

水分是影响植物生长发育的五大关键因子之一，在植物生长发育过程中需要消耗大量的水分。植物体内水分的长距离运输是通过木质部导管或管胞系统进行的，所以木质部栓塞会降低或阻断水分长距离运输。细胞膜上的水通道蛋白决定了水分的跨细胞移动，根系吸收的水分绝大部分是通过水通道蛋白进行，经过具有凯氏带的内皮层进入中柱的导管或管胞，最终运输到茎、叶。在木质部韧皮薄壁细胞中发现大量的水通道蛋白，它们不参与长距离水分运输。然而，它们是否参与木质部栓塞修复？迄今为止，其仍鲜有报道；另外，关于水通道蛋白在整个植物生长发育过程所扮演的角色也值得进一步探究。
　　本研究以84K杨（Poplus alba× Poplus. glandulosa）为试材，对其木质部栓塞修复机制进行初步探讨。并利用基因工程技术，成功克隆了PtPIP1;1，PtPIP1;3，PtPIP1;5，PtPIP2;1，PtPIP2;2，PtPIP2;3，PtPIP2;4，PtPIP2;7和PtPIP2;8这9个PtPIPs基因的cDNA全长，构建了其中5个水通道蛋白基因的植物表达载体，获得84K杨和拟南芥的转基因植株，旨在探讨水通道蛋白在植物生长发育过程所起的作用。主要研究结果如下：
　　1.84K杨木质部栓塞的修复是从上方和下方两个方向同时进行，其木质部栓塞的修复是根系压力和导管周边薄壁细胞中的水通道蛋白共同作用的结果。
　　2.84K杨的栓塞和气孔导度表现出“疲劳”反应，受过胁迫的苗木对温度和湿度更为敏感，其木质部的栓塞脆弱性更大、气孔更为敏感。
　　3.在干旱环境下，84K杨苗木具有较好的自我保护机制。在整个实验过程中，84K杨可以有效保护光合器官免受非可逆性损伤，最大光量子效率PSII（Fv/Fm）一直保持在0.8左右，植物处于健康生长状态。
　　4.应用geNorm、NormFinder和BestKeeper3个软件统计分析，通过Real-timePCR技术，筛选得到干旱-复水处理过程中84K杨木质部薄壁细胞中表达量稳定性较好的内参基因：EIF-5A、EF4-L、UBQ和84K杨根系、木质部薄壁细胞、叶片三个组织中表达量稳定性较好的内参基因：EIF-5A、CYP、UBQ。
　　5.应用各种生物信息学工具对PtPIPs基本物理性质、疏水性、跨膜结构域、功能及其功能位点进行预测分析，结果表明PtPIP1;1，PtPIP1;3，PtPIP2;3，PtPIP2;7和PtPIP2;8基因序列与MIP保守区序列一致，且含有植物质膜内在蛋白C环和E环的特征信号序列，具有与孔道形成有关的高度保守单元；其编码的蛋白质为稳定的疏水性蛋白，跨膜结构域具有典型5个短环相连的6个亲水的跨膜区且分布基本对称。值得指出的是PtPIP2;7和PtPIP2;8不符合N-末端和C-末端位于细胞质一侧的特点；PtPIP1;3含有1个微体C-末端定位信号，PtPIP2;8（285-287）含有1个糖基化位点，其结构特异性可能意味其功能的特异性。因此，我们认为PtPIP1;3、PtPIP2;7和PtPIP2;8具有更大的研究价值。
　　6.通过Real-time PCR技术，得到如下相对表达量排序结果：84K杨和毛白杨的木质部薄壁细胞质膜内在蛋白基因（PtPIPs）排序分别为PIP1;3> PIP2;1> PIP2;3>PIP1;5> PIP2;4> PIP2;2> PIP1;1> PIP1;2和 PtPIP1;3> PtPIP2;3> PtPIP2;2>PtPIP2;1> PtPIP1;1> PtPIP2;7> PtPIP2;4> PtPIP1;5；84K杨的根系排序为PIP1;3>PIP1;1>PIP2;2=PIP2;1>PIP2;4>PIP2;7=PIP2;8>PIP1;5=PIP1;2；84K杨叶片和叶柄排序基本一致：PIP1;3> PIP2;1> PIP2;4> PIP2;3> PIP2;2> PIP1;5> PIP1;1>PIP1;2。根据研究目的选取 PtPIP1;1、PtPIP1;3、PtPIP2;3、PtPIP2;7和 PtPIP2;8进行表达载体构建。
　　7.以pBI121和pBIRNAi植物表达载体为中间载体，成功构建了PtPIP1;1、PtPIP1;3、PtPIP2;3、PtPIP2;7和PtPIP2;8这5个基因的13个植物表达载体（5个超表达植物表达载体、4个RNAi抑制植物表达载体和4个特异启动子植物表达载体）。
　　8.获得PtPIP1;1、PtPIP2;3和PtPIP2;83个基因的异源超表达转基因拟南芥。与野生型拟南芥相比，转PtPIP1;1基因的拟南芥生长发育加快，气孔密度增大；叶片相对含水量增加；叶片栅栏组织细胞变小，气孔变小；离体叶片生长前期开始的几分钟更易失水，后来与野生型基本一致，生长后期的失水率与野生型基本一致。
　　9.获得5个基因的5个超表达植物表达载体、4个RNAi抑制植物表达载体和4个特异启动子植物表达载体的转基因84K杨。经PCR检测，获得全部表达载体的84K杨阳性植株。目前获得大量的扦插苗，并且对转基因后引起的生长状况变化有了初步了解。

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表目录

图目录

第一章 绪论

1.1 文献综述

1.1.1 植物水通道蛋白研究概述

1.1.2 植物水分生理

1.1.3 植物木质部栓塞修复

1.2 研究目标和主要研究内容

1.2.1 目的和意义

1.2.2 研究内容和研究技术路线

第二章 在干旱复水过程中杨树无性系木质部栓塞及其修复的变化

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 试验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 光响应曲线

2.2.2 叶绿素荧光参数

2.2.3 气体交换参数

2.2.4 水导损失率（PLC）和根木质部液流压力

2.2.5 干旱-复水处理84K杨木质部薄壁细胞内参基因的选择

2.2.6 84K杨木质部薄壁细胞质膜内在水通道蛋白相对表达量分析

2.2.7 质膜内在水通道蛋白（PIPs）的表达量变化

2.3 讨论与结论

2.4 小结

第三章 杨树质膜内在水通道蛋白基因克隆、表达和转基因研究

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 PtPIPs基因的克隆与分析

3.2.2 杨树各组织质膜内在水通道蛋白（PIPs）相对表达量分析

3.2.3 PtPIPs基因的生物信息学分析

3.2.4 转基因84K杨和拟南芥初步研究

3.3 讨论与结论

3.3.1 杨树质膜内在水通道蛋白基因（PtPIPs）的克隆

3.3.2 质膜内在水通道蛋白（PtPIPs）的生物信息学分析

3.3.3 质膜内在水通道蛋白(PtPIPs)转基因84K杨和拟南芥

3.4 小结

参考文献

在读期间发表论文

致谢