杜仲EST-SSR引物开发及遗传多样性研究

摘要

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是我国重要的经济和药用树种，单科单属单种，广泛分布在我国的27省（区），其适应性强、病虫害较少，但是杜仲的野生资源已濒临灭绝。相关研究表明杜仲的变异类型丰富，其形态、结构甚至胚胎类型都出现了变异。因此急需从分子生物学的角度对该物种进行遗传学的研究。本研究利用杜仲不同时期叶子和果实的转录组数据自主开发了杜仲SSR标记，在此基础上，以具有代表性的杜仲20居群共136份种质资源为试验材料，对其遗传多样性、亲缘关系、群体内和群体间分化程度、群体遗传结构等开展了系统研究。研究结果为杜仲种质资源的收集保存和进一步开展遗传育种研究提供理论依据。主要研究结果如下:
　　 1.自主开发了杜仲SSR引物。从杜仲叶子和果实转录组数据49610条Unigene序列中，通过生物信息学方法，搜索2～6重复单元的SSR位点共1334条150种，说明转录组数据中SSR位点出现的频率较低，仅为2.9％;其中二、三核苷酸重复单元的种类为最多，占所有SSR位点的92.72％;根据转录组Unigene序列，利用Primer5软件共设计、合成114对引物，进行PAGE电泳检测，并筛选出了13对具有多态性高、稳定性好的引物，其目的片段的长度都在120bp～250bp之间。
　　 2.检测了杜仲SSR位点的遗传多样性。10个SSR位点共检测出73个等位基因，等位基因数（na）在2～13之间，平均每个位点检测出7.3个等位基因;有效等位基因数（ne）为20.18个，平均为2.018个;期望杂合度（He）和观测杂合度（Ho）的范围分别为0.839～0.056和0.586～0.057，平均值分别为0.362和0.290，Nei's平均值为0.361;根据PIC值的高低，将10对引物的有效性排序为:DZ64＞ EU12＞E.17＞ EU108＞ EU69＞ EU96＞ E.29＞ EU29＞ E.37＞ E.19; Hardy-weinberg检测表明，E.17、EU29、E.37、DZ64、EU1085个位点都达到极显著水平，而位点EU12、E.19、E.29、EU69、EU96均未达到显著水平，表明杜仲受到了遗传漂变、突变、迁移和选择等进化因子的干扰。
　　 3.杜仲居群遗传多样性研究表明，在居群水平上，等位基因数(na）在1.7～3.2之间，平均每个居群为2.6个等位基因;有效等位基因数（ne）在1.426～2.299之间，平均有效等位基因数(ne）为1.780个;基因丰度(AR)的范围是1.509～1.893，平均为1.731;观测杂合度（Ho）的范围为0.167～0.450，平均为0.292，期望杂合度（He）的范围为0.252～0.433，平均为0.342; Hardy-weinberg检测表明，除湖南江垭、商丘、新疆三个居群外，其余17个居群都表现出不平衡状态，说明杜仲受到了自然选择、近交、人工选择等诸多因素的影响;遗传分化研究表明，97.40％的遗传分化来自于居群内，仅有2.60％遗传变异来自于居群间。
　　 4.群体遗传结构分析显示，我国杜仲资源的基因交流程度高，纯基因池较少，只有广西、江苏、浙江、洛阳、山西、神农架居群的基因交流较少，在个体水平上有65个样品的基因交流较少，基因池纯度较高。南方和北方的杜仲资源主导基因池颜色不同，北方居群主导基因池的颜色为红色（南方∶北方=1∶5）、绿色（南方∶北方=l∶2）、玫红色（南方∶北方=1∶3），南方居群主导基因池的颜色为黄色（南方∶北方=2∶1），蓝色、青色基因池在南北方居群中的分布比例大约都为1∶1。玫红色的基因池主要分布在河南、湖北神农架居群，其分布范围比较狭窄。
　　 5.聚类结果将20个居群分为4组:第一组为神农架居群，第二组为浙江居群，第三组为洛阳、新乡、商丘、南阳居群;第四组为剩余的14个居群，表明杜仲的亲缘关系较近，遗传交流大。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 国内外分子标记技术研究现状及评述

1．1．3 杜仲国内外研究的现状

1．2 研究目标和主要研究内容

1．2．1 关键的科学问题与研究目标

1．2．2 主要研究内容

1．3 研究技术路线

第二章 杜仲转录组SSR标记开发

2．1 试验材料、试剂和设备

2．1．1 试验材料

2．1．2 主要试剂及配制

2．1．3 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 杜仲转录组SSR位点的查找

2．2．2 SSR引物设计

2．2．3 引物选择

2．2．4 杜仲基因组总DNA的提取

2．2．5 DNA质量检测

2．2．6 SSR-PCR反应体系及反应条件优化

2．2．7 SSR-PCR产物检测

2．2．8 反应体系的验证和引物筛选

2．2．9 数据统计与分析

2．3 结果与分析

2．3．1 杜仲转绿组中SSR位点的分布特点

2．3．2 杜仲转录组SSR的特性

2．3．3 杜仲转录组SSR平均分布距离

2．3．4 SSR引物设计

2．3．5 基因组DNA的提取与检测

2．3．6 SSR-PCR反应体系的直观分析

2．3．7 SSR-PCR优化体系的扩增检测

2．3．8 SSR引物筛选

2．3．9 引物多态性分析

2．4 小结

第三章 杜仲遗传多样性评价

3．1 试验材料、试剂盒及设备

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要试剂及配制及主要试验设备

3．2 方法

3．2．1 杜仲叶组织基因组DNA的提取

3．2．2 杜仲遗传多样性分析的SSR引物

3．2．3 PCR扩增

3．2．3 SSR荧光毛细管电泳

3．2．4 数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 SSR位点遗传多样性分析

3．3．2 杜仲居群间遗传多样性分析

3．3．3 杜仲居群遗传结构

3．3．4 杜仲居群聚类分析

3．3．5 杜仲居群间遗传分化

3．4 小结

第四章 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

4．2．1 引物开发

4．2．2 杜仲遗传多样性分析

4．3 展望

参考文献

附录 图版

在读期间学术研究

致谢