川西云杉早期体细胞胚胎发生机理研究

摘要

川西云杉作为常绿针叶树，广泛分布在我们西南和西藏东部。由于其生长较快且材质优良常被作为造林树种。但是目前川西云杉苗主要是通过实生繁殖，但其实生苗前期生长缓慢，结实比较晚，而且，实生种子园由建园到生产可用种子需时极长，致使川西云杉种子供不应求，远远不能满足造林需求。采用体细胞胚胎发生技术繁殖川西云杉优良无性系，可解决其生产上种苗供应不足的问题奠定基础。体细胞胚胎发生的能力受基因型的影响且没有完全被研究清楚。本研究从转录组学和蛋白质组学两个水平来研究川西云杉一个胚胎发生能力良好的细胞系在添加不同浓度6-BAP的培养基上长期继代后的基因和蛋白质变化。为了研究川西云杉早期胚胎发生的分子机制，本文采用最新的RNA-Seq技术对不同基因型的胚性与非胚性愈伤组织之间的差别进行了研究，然后结合RNA-Seq，iTRAQ以及GS-MS技术对不同浓度6-BAP对胚胎发生能力的影响进行了深入的探讨。最后还对激素，抗氧化酶和多胺进行了测定以进一步阐明体细胞胚胎发生早期的发生机理。主要结果如下: 以川西云杉8个基因型不同发育阶段的合子胚为外植体，探索不同发育阶段，基本培养基以及不同激素等添加剂对川西云杉胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚的分化、萌发的影响。Stage2为最适于胚性愈伤组织诱导和体胚诱导的发育阶段;1/2LM培养基+10μM2，4-D+5μM6-BAP+3.8μM ABA或20μM AgNO3是诱导胚性愈伤组织最适的培养基，愈伤组织诱导率最高为40％;1/2LM培养基+61μM ABA+0.4％活性炭是体细胞胚诱导和分化的最佳培养基，平均每100mg胚性愈伤组织可以形成124个体细胞胚;最适体细胞胚萌发培养基为1/4LM+0.125％活性炭+50μM抗坏血酸，最高萌发率为24.83％。该研究发现脱落酸，硝酸银均可将川西云杉胚性愈伤组织的诱导率提高10％以上。 转录组测序一共获得54978834条reads，经过滤比对后共得到68070条unigene，其中18897条(27.8％)unigene在GO中找到分类，15439条(22.7％) unigene可以比对到121个KEGG的通路，这些基因所属类别占所有功能类别中的绝大多数。数字表达谱升级版测序的分析结果表明胚性与非胚性愈伤组织间共有3280个差异表达的基因，其中1371个上调的，1909个下调的（P＜0.05）。影响胚胎发生能力的基因参与很多通路，包括植物-病毒交互作用，淀粉和蔗糖代谢，植物激素信号转导。此外SERK和阿拉伯半乳糖蛋白可以作为早期胚胎发生中胚性愈伤组织的分子标记。 RNA-seq和iTRAQ去低质量之后分别获得51375个unigene和2617个蛋白，其中有2770个转录因子可以比对到蛋白质上。对差异表达的unigene和蛋白进行GO分析表明unigene和蛋白大多参与细胞和结合作用，它们的代谢途径富集在核糖体和谷胱甘肽代谢。核糖体蛋白，谷胱甘肽S-转移酶蛋白，germin-like蛋白和不依靠钙调素蛋白酶在胚胎发生能力强的愈伤组织(3.6μM)中的表达量均高于低胚胎发生能力中的。qRT-PCR验证表明与胚胎发生能力相关的基因在转录水平上显著上调。上述四种蛋白及其转录因子是早期胚胎发生能力的候选分子标记。 采用GS-MS技术研究三种浓度6-BAP处理下愈伤组织的代谢物变化。一共获得了309个代谢物，其中(12339.8％)个代谢物可以比对到KEGG中。3个处理间有35个代谢物的含量发生了极显著的变化，其中2.5μM和5μM两个6-BAP处理间有差异代谢物32个。共有17个代谢物质只存在于1组比较中。S-plot和Loading plot表明在较高胚胎发生能力的愈伤组织中含量增加的代谢物大多为氨基酸，而大多碳水化合物（尤其是各种糖类）的含量是降低的。这些结果表明6-BAP可能通过氮代谢影响愈伤组织的胚性发生能力，如调控天冬氨酸盐，异亮氨酸和亮氨酸。此外，胚胎发生能力最强的愈伤组织中（3.6μM）色氨酸的含量最低，其可以通过很多途径生成愈伤组织诱导和增殖的必要内源激素IAA，由此我们推测6-BAP可能通过调控色氨酸的含量间接的影响愈伤组织中IAA的含量从而影响其胚胎发生能力。天门冬酰胺和色氨酸，丝氨酸等可作为胚胎发生能力的标记代谢物。 三个基因型的胚性愈伤组织中四种激素的含量均较非胚性愈伤组织中的含量低。而胚性愈伤组织的SOD活性以及多胺的含量则均显著高于非胚性愈伤组织。3.6μM6-BAP处理的愈伤组织中IAA的含量和SOD的活性最高，ZR的含量和POD的活性最低，分化后IAA和ZR的含量均要低于其它两个处理，而GA3和ABA的含量则均高于其它两个处理。3.6μM6-BAP处理的愈伤组织中多胺的含量要高于其它两个处理，特别是分化培养之后。 综上所述，川西云杉早期体细胞胚胎发生是涉及复杂的生理机制和分子水平上的基因、蛋白以及代谢物的参与，是它们相互作用的结果。对川西云杉早期体细胞胚胎发生调控机理的研究，为得到高胚胎发生能力的愈伤组织奠定了基础，并为体细胞胚胎发生技术在针叶树上的应用提供了重要依据。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 研究目的和意义

1．1．3 项目来源与资金支持

1．2 针叶树体细胞胚胎发生的研究进展

1．2．1 诱导和增殖过程的调控

1．2．2 成熟阶段的调控

1．2．3 萌发阶段的调控

1．3 体细胞胚胎发生分子机理研究进展

1．3．1 转录组学

1．3．2 蛋白质组学

1．3．3 代谢组学

1．4 主要研究目标和研究内容

1．4．1 研究目标

1．4．2 研究内容

1．4．3 创新性

1．5 技术路线

第二章 川西云杉体细胞胚胎发生体系建立

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂和仪器

2．1．3 培养条件

2．1．4 统计分析

2．1．5 石蜡切片的制备

2．2 结果与分析

2．2．1 胚性愈伤组织的诱导

2．2．2 体细胞胚的诱导

2．2．3 体细胞胚的萌发

2．3 小结

第三章 不同基因型胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织的转录组测序和数字化表达谱分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 主要试剂和仪器

3．1．3 研究方法

3．1．4 内参基因的选择

3．1．5 目标基因的qRT-PCR

3．2 结果与分析

3．2．1 转录组测序分析

3．3．2 数字化基因表达谱分析

3．2．3 与体胚发生相关DEGs的qRT-PCR验证

3．3 小结

第四章 6-BAP对川西云杉愈伤组织胚胎发生能力影响的转录组和蛋白质组分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 主要试剂和仪器

4．1．3 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 不同浓度6-BAP处理对愈伤组织中早期体细胞胚及其分化和萌发的影响

4．2．2 转录组测序

4．2．3 蛋白质组学

4．2．4 蛋白质组学和转录组关联分析

4．2．5 qRT-PCR验证

4．3 小结

第五章 不同浓度6-BAP对川西云杉愈伤组织胚胎发生能力影响的代谢组学研究

5．1 材料和方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 主成分分析

5．2．2 三组样品两两比较

5．2．3 差异代谢物

5．3 小结

第六章 川西云杉早期体胚发生生理生化研究

6．1 材料和方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 胚性与非胚性愈伤组织间激素、抗氧化酶及多胺的差异分析

6．2．2 6-BAP对愈伤组织内源激素、抗氧化酶及多胺的影响

6．3 小结

第七章 结论与讨论

7．1 结论

7．2 讨论

7．2．1 川西云杉体细胞胚胎发生体系的建立

7．2．2 胚性与非胚性愈伤组织间差异的分子机理

7．2．3 6-BAP对愈伤组织分化能力影响的分子机制

7．2．4 6-BAP对愈伤组织中代谢物含量的影响

7．2．5 胚性与非胚性愈伤组织之间生理差异及6-BAP对愈伤组织分化能力影响的生理机制

7．3 展望

参考文献

附录

在读期间的学术研究

致谢