基于SSR标记的血皮槭天然群体遗传变异研究

摘要

血皮槭(Acer griseum(Franch.)Pax)，属于槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)，中国特有、濒危植物，是优秀的世界著名的园林观赏树种。目前国内对血皮槭的研究较少，主要集中于种子繁殖、组织培养、野生资源天然更新调查及其生态适应性的研究，缺乏对其天然群体遗传水平的研究，且没有提出对该物种遗传资源实施保护的科学策略。基于分子手段的血皮槭遗传多样性分析以及群体遗传结构的研究是进行遗传资源保护及利用的先决条件。因此，本研究通过对血皮槭进行SSR引物的开发并利用所开发的引物对血皮槭物种及11个天然群体进行遗传多样性和群体遗传结构的研究，从而为其遗传资源保护策略的制定奠定理论基础。主要研究结论如下: 1.血皮槭SSR引物的开发及多态性验证 通过PCR反应检测阳性克隆菌落，共挑选出了103个阳性克隆菌落，并对其进行测序。根据测序获得的SSR位点信息，设计了59对SSR引物，设计成功率为57.3％。通过琼脂糖电泳初筛以及聚丙烯酰胺电泳复选，最终从所开发的59对SSR引物中筛选出了27对具有多态性的引物。并利用88个样本对27个多态性位点进行毛细管电泳检验，通过相关遗传参数的计算反映了标记位点的多态性水平。其中位点的等位基因数范围(Na)2-14;观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态性丰富度指数(PIC)分别为0.384-0.897、0.000-0.934、0.436-0.877。 2.血皮槭天然群体遗传多样性分析 利用毛细管电泳方法对血皮槭11个群体288个样本在27个微卫星位点上的遗传多样性进行检测分析。物种水平上等位基因参数Na、Ne范围分别是5～15、1.893～8.511;物种水平上遗传多样性参数I、Ho、He、Nei's遗传多样度、PIC的范围分别为1.047～2.163、0.121～0.780、0.472～0.884、0.472～0.882、0.603～0.638，平均值分别为1.643、0.501、0.727、0.725、0.678。数据显示血皮槭物种具有较高的遗传多样性。群体水平上等位基因参数Na、Ne范围分别是4.273～6.727、2.821～3.748;群体遗传多样性参数I、Ho、He、Nei's遗传多样度、PIC的范围分别为1.069～1.415、0.321～0.560、0.554～0.684、0.543～0.680、0.619～0.852，平均值分别为1.227、0.490、0.631、0.622、0.614。数据显示群体水平也具有较高的遗传多样性。根据血皮槭不同群体遗传多样性参数的综合得分排名结果显示，重庆城口(CHK)＞湖北兴山(XS)＞河南内乡(NX)＞河南栾川(LC)＞甘肃天水(TS)＞陕西眉县太白山(TBS)＞湖北神农架(SNJ)＞湖北五峰(WF)＞湖南沅陵(YL)＞河南西峡(TPZ)＞山西阳城(YC)，其中CHK群体遗传多样性水平最高，YC群体遗传多样性水平最低。同时，研究还发现血皮槭自然分布区中心群体的遗传多样性比其周边群体的遗传多样性高。综合分析结果，认为血皮槭的遗传多样性并不是导致其濒危的主要原因之一。 3.血皮槭天然群体遗传结构研究 群体遗传分化系数Fst范围为0.0924～0.3656，平均是0.1500，说明血皮槭群体的遗传分化主要存在于群体内部，群体间遗传分化较小。AMOVA分析也得到了同样的结果，认为血皮槭群体79.2％的变异来自于群体内部。群体间基因流Nm范围为0.4338～2.4557，平均是1.4164，较大的基因流是血皮槭群体遗传分化较低的原因之一。近交系数的研究结果发现，血皮槭群体内均存在不同程度的近交现象。群体的遗传距离和遗传一致性聚类结果将全部群体分为三个类群:第一类包括YL、CHK、WF、XS、SNJ、TPZ、LC群体;第二类是NX、TBS、TS群体;第三类就只有YC群体;STRUCTURE遗传结构聚类分析显示，种群间存在一定的基因渗透现象;全部个体的邻接法聚类表明，秦岭东段的血皮槭群体涵盖两个类群，其遗传资源丰富度相对较高。血皮槭群体的地理距离与遗传距离具有显著的正相关性(r=0.5392，p＜0.05)。 4.血皮槭遗传资源保存策略 鉴于血皮槭野生资源群体数量下降，并且野生大树结实较少，并且不同群体遗传多样性水平不同，建议以原地保存为主开展血皮槭遗传资源的直接保护。本文研究结果表明重庆城口(CHK)群体遗传多样性最高，建议应该考虑其作为优先保护的单元，建立小范围保护区域从而减少人为的干扰与破坏，使其野生资源得到更好的恢复。另一方面，由于其观赏价值极高，避免对野生资源的过渡采伐与利用，建议加大血皮槭的驯化栽培研究，培育大量的栽培资源，从而减轻对野生资源的压力，使野生资源得到更好的间接的保护。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 研究背景

1．3 国内外研究现状

1．3．1 遗传多样性的研究意义

1．3．2 遗传多样性的研究方法

1．3．3 濒危物种的遗传多样性和群体遗传结构

1．3．4 SSR标记在遗传多样性研究中的应用

1．3．5 血皮槭研究现状

1．4 研究目标意义和主要研究内容

1．4．1 研究目的和意义

1．4．2 主要研究内容

1．4．3 研究技术路线

第二章 血皮槭SSR引物的开发

2．1 血皮槭采样

2．1．1 采样方法

2．1．2 采样地点及生境条件概况

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．3．1 DNA提取及检测

2．3．2 DNA双酶切

2．3．3 磁珠富集含SSR位点的片段

2．3．4 阳性克隆筛选

2．3．5 序列分析以及引物的设计

2．3．6 SSR引物筛选

2．3．7 SSR引物多态性验证

2．4 结果与分析

2．4．1 DNA提取与纯度检验

2．4．2 短基因组片段的获取

2．4．3 SSR富集文库

2．4．4 阳性克隆筛选

2．4．5 SSR引物设计

2．4．6 多态性引物的筛选

2．4．7 SSR多态性引物检验

2．5 小结

第三章 血皮槭遗传多样性与群体遗传结构分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 试剂与仪器

3．1．3 DNA的提取与引物的选择

3．1．4 PCR扩增

3．1．5 毛细管电泳检测

3．1．6 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 SSR位点的中性检验

3．2．2 Hardy-Weinberg平衡和LD检验

3．2．3 血皮槭的遗传多样性水平

3．2．4 血皮槭群体遗传结构研究

3．2．5 遗传距离、遗传一致度及聚类分析

3．2．6 遗传距离与地理距离相关性分析

3．3 讨论

3．3．1 血皮槭遗传多样性

3．3．2 血皮槭群体遗传分化、基因流及分布格局

3．3．3 血皮槭遗传资源保存策略

3．4 小结

第四章 结论与展望

4．1 主要结论

4．2 展望

参考文献

附录

在读硕士研究生期间的学术研究

致谢