毛竹GRAS转录因子家族全基因组分析及PeSCR和PeSCL3的功能研究

摘要

GRAS转录因子是植物特有的一类转录因子，在植物发育和信号转导方面，如根发育、顶端分生组织维持、侧生分生组织发育、赤霉素信号传导以及光敏色素A信号传导等，均具有重要作用。竹类植物生长速度快，用途广，是最具潜力的绿色资源之一，其生长发育倍受关注。本文以毛竹（Phyllostachys edulis）为研究对象，在对全基因组GRAS转录因子家族数量、基因结构、功能预测分析的基础上，对PeSCR和PeSCL3基因进行了深入研究，以期为揭示它们在毛竹生长发育中的功能奠定基础，为竹子的分子育种提供理论参考依据。主要研究结果如下:
　　1.通过生物信息学方法，从毛竹基因组数据库中获得了59条基因序列预测编码GRAS转录因子，对基因结构、氨基酸组成、蛋白基序以及系统进化等进行了系统分析。结果表明，毛竹中的GRAS转录因子分别属于AtSCL4/7（1个）、HAM（13个）、AtSCR（4个）、DLT（2个）、AtSCL3（4个）、DELLA（2个）、AtPAT1（13个）、AtSHR(4个)和LISCL（10个）九个亚家族，每个亚家族含有保守基序，意味着具有特异的功能。但是在现有的毛竹基因组中未发现AtLAS亚家族的成员。
　　2.采用qPCR方法对基因的表达模式进行了检测，结果表明:除了PeGRAS-41和PeGRAS-55基因没有检测到外，其余57个基因的表达呈现不同的模式。相对于其他成员的表达量，HAM亚家族成员PeGRAS-10和PeGRAS-12的表达丰度差异明显(p＜0.01)，而且在茎中表达量最高，推测其可能在毛竹茎发育过程中起重要作用。AtSCR亚家族成员PeGRAS15-18在根中表达最弱，说明AtSCR亚家族在毛竹中不仅参与根的发育，还可能参与其他组织的发育。AtPAT1亚家族PeGRAS-39只在茎和鞘中表达，而且鞘中的表达量远远高于茎，表明该基因可能在鞘的发育中发挥着重要作用。AtPAT1亚家族成员PeGRAS-43在叶中的表达量最高，这与AtPAT调控光敏色素途径相符。而PeGRAS-32～PeGRAS-37基因均在根中的表达量最高。
　　3.为深入研究毛竹根系的生长发育调控，从毛竹中分离出PeSCR和PeSCL3基因。PeSCR基因全长为2298 bp，5'UTR为238 bp，3'UTR为134 bp，编码区为1926 bp，编码641氨基酸，对应的基因组序列为2598 bp，含有一个内含子;PeSCL3基因全长为1978bp，5'UTR为340 bp，3'UTR为303 bp，编码区为1335 bp，编码444氨基酸，毛竹的PeSCL3基因组全长也是1335 bp，没有内含子。氨基酸结构分析表明，PeSCR和PeSCL3氨基酸序列不仅含有GRAS家族五个保守域，而且分别含有AtSCR和AtSCL3亚家族特有的保守序列motifⅠ、motifⅡ和motifⅢ。
　　4.基因表达模式检测结果表明，PeSCR基因主要在叶和根中表达，PeSCL3基因在根、茎和叶中都表达。不同激素处理和非生物胁迫处理后PeSCR和PeSCL3的表达差异明显，PeSCR的表达短时间内(1 h)受GA3的抑制，随处理时间延长，基因的表达受到诱导;PeSCR的表达总体受到受外源ABA和NaCl处理的抑制;干旱处理条件下PeSCR基因呈先诱导，最后受到抑制。PeSCL3基因经GA3处理后，先受抑制后又逐渐恢复;经ABA处理总体受到诱导;干旱处理和NaCl处理毛竹后PeSCL3均受到诱导。
　　5.采用转基因的技术，研究了PeSCR和PeSCL3基因的功能。分别构建了PeSCR和PeSCL3的正义、反义植物表达载体，采用蘸花法转化模式植物拟南芥。结果表明，转反义PeSCR的转基因株系呈现粗植株矮小，叶片较小，根部发育缓慢的表型;而正义转基因植株与野生型基本一致，或比野生型健壮，根发育稍快或基本与野生型同步，一定时期后比野生型数目稍多。转反义PeSCL3的转基因株系与野生型植株植株大小和叶片的大小没有明显差异，但经PAC处理后反义植株的根系的数目比野生型明显减少(p＜0.05)。表明毛竹PeSCL3基因可能调控根部GA生物合成调控根的发育。
　　6.研究了PeSCR和PeSCL3基因启动子的活性。分别克隆了PeSCR和PeSCL3的启动子区域1820 bp和1358 bp，将其构建到pBI101的多克隆位点，分别形成了由PeSCR和PeSCL3启动子驱动的GUS报告基因表达载体，转化拟南芥，经抗性筛选获得转基因植株。组织化学染色结果表明，转PeSCL3启动子的转基因植株经染色后，在根部、叶片、叶柄和顶端部位均观察到蓝色，编码克隆的启动子具有生物活性。而转PeSCR启动子的转基因植株经染色后没有观察到蓝色。
　　根系是植物吸收水分、养分的重要器官，其生长发育对整个植物的生物产量具有重要影响。对毛竹GRAS家族成员PeSCR和PeSCL3的研究，对于深入了解毛竹根系的生长发育调控具有重要的参考价值，有助于未来通过基因工程来实现对竹类植物的性状进行分子调控。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 引言

1．1．1 研究背景

1．1．2 基因家族定义与特点

1．1．2 转录因子的结构

1．1．3 全基因组水平研究植物转录因子家族

1．1．4 GRAS基因家族研究进展

1．1．5 研究目的与研究目标

1．1．6 技术路线

第二章 毛竹GRAS转录因子家族全基因组分析

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 主要软件和网络资源

2．1．5 实验引物

2．2 实验方法

2．2．1 GRAS家族成员的查找

2．2．2 GRAS家族系统进化树的构建

2．2．3 毛竹GRAS的基因结构

2．2．4 毛竹GRAS的蛋白结构的分析和保守域预测

2．2．5 毛竹RNA提取和qPCR检测

2．3 实验结果

2．3．1 GRAS序列的查找

2．3．2 GRAS家族系统进化分析

2．3．3 毛竹GRAS的基因结构

2．3．4 毛竹GRAS的蛋白结构的分析和保守域预测

2．3．5 毛竹GRAS基因不同组织的表达分析

2．4 本章小结

第三章 毛竹PeSCR和PeSCL3基因的功能研究

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株与载体

3．1．3 试剂

3．1．4 主要仪器

3．1．5 培养基

3．2 实验方法

3．1．6 实验引物

3．2．1 毛竹叶片DNA的提取和检测

3．2．2 毛竹总RNA的提取及其检测

3．2．3 cDNA第一条链的合成

3．2．4 毛竹PeSCR和PeSCL3基因的克隆和分析

3．2．5 PeSCR和PeSCL3基因的时空表达分析

3．2．6 PeSCR和PeSCL3基因植物表达载体构建及研究

3．2．7 转基因植株检测

3．2．8 PeSCR和PeSCL3上游启动子序列的克隆

3．3 结果与分析

3．3．1 毛竹DNA的提取

3．3．2 毛竹不同组织RNA提取

3．3．3 PeSCR和PeSCL3基因克隆

3．3．4 PeSCR和PeSCL3基因的基因组序列克隆

3．3．5 PeSCR和PeSCL3序列特征分析和进化分析

3．3．6 PeSCR和PeSCL3基因的表达分析

3．3．7 PeSCR和PeSCL3植物正、反义表达载体构建

3．3．8 拟南芥异位表达植株表型分析

3．3．9 PeSCR与PeSCL3基因的上游启动子克隆与功能分析

3．4 本章小结

第四章 结论与讨论

4．1 结论

4．2 讨论

4．2．1 毛竹GRAS家族成员

4．2．2 毛竹PeSCR和PeSCL3基因的功能

4．3 展望

参考文献

附录

在读期间学术研究

致谢