基于转录组测序的鼓槌石斛花色花香形成分子调控机理研究

摘要

石斛属（Dendrobium），隶属于兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendreae)，因其花形奇特、花色丰富和花香四溢的特性，成为重要的花卉种质资源，已经培育了大量的人工杂交品种，但缺乏花朵纯明黄色且具有花香的品种，而在自然种中，鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）的花不仅为纯正的明黄色，同时拥有芬芳的香气。因此，本研究以鼓槌石斛为对象，采用英国皇家园艺学会比色卡和分光色差仪对鼓槌石斛各个花期的颜色进行鉴别;利用合相色谱串联三重四极杆质谱仪（UPC2-MS/MS）进行类胡萝卜素定性、定量分析;利用超高效液相色谱-电喷雾离子化-多级质谱联用技术(UPLC-ESI-MSn)进行类黄酮和花青素定性、定量分析;运用固相微萃取(SPME)结合GC-MS技术测定花朵挥发性组分及其含量变化;对鼓槌石斛花瓣组织的RNA提取方法进行了优化和改良;运用Illumina测序技术对鼓槌石斛不同发育时期的整朵花进行转录组测序，同时利用qRT-PCR技术分析了石斛的类胡萝卜素和萜烯类合成途径中差异基因的表达模式，从而对其花色和花香形成的分子调控机理进行研究。主要研究结果如下:
　　(1)鼓槌石斛花蕾期的花瓣为绿色;透色期的花瓣为黄绿色;最后开放期的花瓣为明黄色。在鼓槌石斛的花瓣开放过程中明度、亮度和彩度先上升后下降，大约在第3-5天时达到最高。在鼓槌石斛透色期和盛开期的花瓣中均没有检测到类黄酮和花青素，认为花瓣呈黄色与花青素和类黄酮无关。在透色期花瓣中检测到叶黄素含量为125.62μg/g、花药黄质为18.35μg/g和玉米黄质为59.34μg/g;盛花期中花瓣的类胡萝卜素总量迅速增加，其中叶黄素、花药黄质和玉米黄质含量分别增加40.47μg/g、89.85μg/g和397.06μg/g。认为叶黄素、花药黄质和玉米黄质是鼓槌石斛花朵呈黄色的主要代谢物质。
　　(2)在中午12点到14点之间，对鼓槌石斛花朵透色期、半开期、盛开期和衰败期的香气成分进行测定，共鉴定出挥发性组分33种。透色期香气含量为5.2 nmol·花-1，香气物质有3种，主要是萜烯类;初开期挥发性物质总量为13.48 nmol·花-1，6种香气物质为酯类和萜烯类，分别占总香气释放量的44.2％和55.8％;盛开期迅速上升到167.48nmol·花-1，检测到31种香气物质，以酯类和萜烯类为主，占总香气的53.6％和30.2％;在衰败期下降到10.36 nmol·花-1，萜烯类占到93.3％。鼓槌石斛盛开期花朵在一天中不同采样时间的花香物质中共鉴定出挥发性组分31种，8:00时香气总释放量为99.08nmol·花-1，14种香气物质，以酯类、萜烯类和醛类为主，释放量分别占总香气成分的53.0％和32.2％。11:00时总释放量增加到122.86 nmol·花-1，香气物质增加到23种。14:00时达到最高167.48 nmol·花-1，31种香气物质的释放量在此时也达到最大值，酯类和萜烯类分别占总香气成分的53.6％和30.2％。17:00时减少为56.3 nmol·花-1，醇类和萜烯类组分明显减少，释放量也减少为11.8％和5.0％。20:00时仅为25.07 nmol·花-1，仅有6种香气物质，占总香气成分的80.1％。通过对各挥发性物质香气值（含量/嗅感阈值）的测定，发现鼓槌石斛呈现香气的主要物质为单萜类，如β-罗勒烯、α-蒎烯、β-蒎烯和D-柠檬烯等。
　　(3)以鼓槌石斛透色期、半开期、盛开期和衰败期的整朵花为样品进行转录组测序，共产出18817483680nt数据。利用de novo组装技术组装出60711个Unigene。通过基因功能注释和差异表达分析，得到了13个与类胡萝卜素合成相关的基因，分别是PSY、PDS、ZDS、CRTISO、ZISO、LCYB、CHYB、VDE、ZEP、LCYE、CYP450、NCED和CCD1;与萜类合成相关的4个基因GPPS、DXR、DXS和TPS。
　　(4)对已获取的13个类胡萝卜素合成相关的基因在鼓槌石斛花朵的幼蕾期、蕾期、透色期、半开期、盛开期和衰败期进行qRT-PCR。结果表明:PSY在花朵发育幼蕾期、蕾期、透色期和半开期持续表达，且表达量基本稳定，这可能显示与类胡萝卜素在花朵发育过程中能够持续合成有关;LCYE和CYP450在花朵发育的幼蕾期到盛开期间持续表达，且变化不大，这可能与叶黄素在花瓣中能够持续合成相关;LCYB在花朵发育过程中的表达量总体升高，并在盛开期表达量达到最大值，可能是花朵在发育过程中叶黄素生物合成增加的原因;PDS、ZDS、CRTISO和ZISO在鼓槌石斛花开放过程中表达量迅速增加，这与着色过程中类胡萝卜素含量的迅速增加相一致，因此这些基因表达量的上升是类胡萝卜素含量快速增加的原因之一;LCYB、CHYB和VDE的表达量在花朵的盛开期达到了顶峰，这三个基因都与玉米黄质和花药黄质的合成有关，因此这三个基因可能是玉米黄质和花药黄质在盛花期含量得到显著增加的主要因素;NCED能够使花药黄质分解，且其产物是脱落酸(ABA)合成前体，它的表达量在整个花期的各个阶段表现出持续增高的现象，且在衰败期达到了最高值，因此NCED对于β-胡萝卜素的降解可能起主导作用且贯穿整个花期，同时它可能也参与花朵的衰老进程;CCD1也参与类胡萝卜素的分解，它的表达量在半花期时达到了最高，表明它主要在半花期时参与了类胡萝卜素的分解。同时，也将这13个基因在铁皮石斛和鼓槌石斛的盛花期的花瓣中进行qRT-PCR，是结果表明鼓槌石斛花瓣中PSY、PDS、ZDS、LCYE、ZEP、NCED和CYP450的表达量低于这些基因在铁皮石斛中的表达量。而ZISO、CRTISO、LCYB、CHYB、DE和CCD1在鼓槌石斛花瓣中的表达量高于在铁皮石斛中的表达量。因此，鼓槌石斛花瓣中ZISO、CRTISO、LCYB、CHYB和VDE的大量表达可能是造成铁皮和鼓槌石斛花朵颜色产生差异，以及鼓槌石斛花朵含有更多类胡萝卜素的原因。
　　(5)将参与萜烯类主链合成通路中的4个结构基因和参与类胡萝卜素分解的CCD1基因在鼓槌石斛花朵的透色期、半开期、盛开期和衰败期，以及铁皮石斛的盛花期中进行qRT-PCR。结果表明，这5个基因在鼓槌石斛盛花期花瓣中的表达量远高于在铁皮石斛中的表达量。同时，GPPS、DXS、DXR和TPS的表达量在花瓣的透色期和半开期之间有一个迅速升高的过程，并在半开期时达到了最高，随后表达量开始下降。这与鼓槌石斛花朵萜烯类挥发性物质的含量变化相一致。因此，GPPS、DXS、DXR和TPS这四个基因可能是鼓槌石斛花朵能够产生萜烯类挥发性物质的主要原因。参与类胡萝卜素分解的CCD1在鼓槌石斛中表达量的变化趋势与GPPS、DXS、DXR和TPS的表达量变化趋势相似，且在鼓槌石斛盛花期花朵中CCD1的表达量远高于在铁皮石斛中的表达量。CCD1能够催化分解类胡萝卜素，且某些分解产物能够参与合成一些挥发性物质。因此，CCD1可能参与了鼓槌石斛花香物质的合成。
　　本研究探讨了鼓槌石斛花朵颜色的形成机理;明确了鼓槌石斛花朵特征香气物质;通过转录组分析和qRT-PCR技术筛选出了参与鼓槌石斛类胡萝卜素和萜烯类生物合成关键酶。在鼓槌石斛的花朵中，通过DXS和DXR等酶催化合成的异戊烯焦磷酸(IPP)是鼓槌石斛花香产物中萜类合成的重要中间产物，也是鼓槌石斛花瓣中类胡萝卜素的合成前体。同时，鼓槌石斛CCD1在花瓣中的大量表达，参与了部分类胡萝卜素的裂解，其裂解产物可能是一些挥发性萜类物质的合成前体。因此，通过对IPP代谢途径和CCD1的调控，可以达到鼓槌石斛花色花香共调控的目的。这些结果为未来通过基因工程对石斛品种的改良提供理论依据。

目录

声明

摘要

图目录

表目录

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 石斛兰花香和花色的相关研究进展

1．3 植物花色与花香研究进展

1．3．1 植物花色的研究进展

1．3．2 类胡萝卜素的生物合成和参与基因

1．3．3 花香生物合成及基因表达调控

1．3．4 花色和花香的联系

1．4 现代色谱法在花色素和花香分析中的应用

1．5 高通量测序技术

1．6 研究目标和主要研究内容

1．6．1 研究目标

1．6．2 主要研究内容

1．7 研究技术路线

第二章 鼓槌石斛花色和花香的成分分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．1．3 实验耗材与设备

2．1．4 数据分析

2．2 结果

2．2．1 花瓣发育过程中的颜色变化

2．2．2 花瓣色素成分分析

2．2．3 不同花期香气成分及香气日变化规律

2．3 讨论

2．3．1 鼓槌石斛的花色成分分析

2．3．2 鼓槌石斛的花香成分分析

2．4 结论

第三章 基于转录组的鼓槌石斛花色和花香形成分析

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．1．3 实验仪器与耗材

3．1．4 数据分析

3．2 结果

3．2．1 RNA的抽提

3．2．2 鼓槌石斛花朵的转录组测序分析

3．2．3 鼓槌石斛花朵不同时期类胡萝卜素合成基因的qRT-PCR

3．3 讨论

3．3．1 鼓槌石斛花瓣的RNA提取方法

3．3．2 鼓槌石斛花瓣的类胡萝卜素生物合成途径

3．3．3 鼓槌石斛花朵香气成分的生物合成途径

3．3．4 鼓槌石斛花色和花香合成途径关联分析

3．4 结论

3．4．1 鼓槌石斛花瓣4个时期的转录组分析

3．4．2 鼓槌石斛花的类胡萝卜素生物合成

3．4．3 鼓槌石斛花的花香成分合成通路

3．4．4 鼓槌石斛类胡萝卜素和萜类合成途径的关联

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢