沙棘对干旱胁迫和复水响应的生理及分子机制

摘要

沙棘（Hippophae rhamnoides）属于胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)，在我国分布广泛，主要集中于我国的半干旱地区。随着全球气候变化，我国所处的亚洲气温上升明显，降水量呈现下降趋势，沙棘将面临着更为严峻的干旱气候挑战。植物在长期进化中，形成了系统的响应干旱胁迫的分子机制。目前，虽然对干旱胁迫下沙棘的生理生化和差异表达蛋白质进行了研究，但是，在基因表达及调控水平研究沙棘响应干旱胁迫的分子机制尚未开展。为此，本研究选择耐旱性差异较大的2个沙棘品种（中国沙棘‘丰宁’和蒙古沙棘‘向阳’）进行模拟自然环境中土壤干旱及复水试验，对2个沙棘品种在不同干旱程度的植株水分关系和光合生理特性进行测定，比较了2个沙棘品种对水分变化响应的差异性和共性。选取正常水分、重度干旱胁迫和复水3个状态下的沙棘叶片进行转录组测序，对转录组数据进行分析，从基因表达水平揭示沙棘响应干旱胁迫的信号转导和基因调控机制。通过Western blot试验验证了H3K9ac抗体与沙棘组蛋白的结合能力，并使用H3K9ac抗体进行ChIP试验。对富集到的沙棘DNA片段进行高通量测序，从而绘制了沙棘H3K9乙酰化修饰图谱，并鉴定出沙棘H3K9乙酰化修饰调控基因。获得主要结果如下:
　　(1)‘向阳’在控水第22天，即土壤体积含水量为19.4％左右时出现叶片干缩，而‘丰宁’在第33天(土壤体积含水量为11.66％)左右出现。随着土壤体积含水量的降低，2个沙棘品种的叶片水势下降，并且‘丰宁’下降幅度要大于‘向阳’。与光合生理相关的最大净光合速率、蒸腾速率、气孔导度、光饱和点、表观量子效率均随着干旱程度加深而下降，而光补偿点出现上升，水分利用效率先上升后下降，‘丰宁’干旱处理组的暗呼吸速率出现先下降后恢复趋势，而‘向阳’干旱处理组先不变后上升。复水后各生理指标出现不同程度的恢复。在干旱胁迫下，‘丰宁’和‘向阳’沙棘形态特征、叶片水势和光合生理都表现出明显的变化，真实反映了沙棘在自然干旱环境中的变化。通过叶片水势和光合生理等比较，‘丰宁’比‘向阳’具有更强的耐旱性。沙棘虽是强耐旱植物，但其耐旱能力有限，在人工林的培育过程中，在极度干旱情况下，沙棘叶片出现干缩，要及时灌溉，以免对沙棘生长造成不可恢复的伤害。
　　(2)干旱胁迫严重影响了沙棘叶片组织中的基因表达，‘丰宁’和‘向阳’中分别发现4618个和6100个差异表达基因，对2个品种进行复水后，差异表达基因数量迅速减少，分别有7个和26个，表明了干旱胁迫对不同品种间基因表达和干旱后复水的恢复能力的差异影响。对差异表达基因进行GO和KEGG分析发现，2个沙棘品种在响应干旱胁迫中，具有相似的响应机制，在光合系统等相关功能上显著富集，从基因表达水平解释了净光合速率显著变化的原因。研究共预测和鉴定出3171个新的基因和970个转录因子，完善和丰富了沙棘自身基因组信息，新基因参与到了101个代谢通路中，其中参与代谢合成的基因最多。转录因子分布于71个基因家族中，MYB家族包含最多基因。基于基因共表达网络构建和公共干旱基因数据库，共筛选到194个干旱胁迫响应核心基因，阐明了以ABA依赖信号途径为主的信号传递途径和以类黄酮途径为主的氧自由基清除途径的耐旱分子机制，并发现了两个途径之间新的联系和丰富了不同途径间基因表达调控机制。转录因子的蛋白质互作关系，对沙棘响应干旱胁迫机制进行了补充。
　　(3)通过Western blot试验验证了H3K9ac抗体与复合物具有较强的结合能力。沙棘片段化DNA的富集以及高通量测序证明了抗体能够用于研究沙棘的组蛋白修饰类型，对富集到的DNA片段进行高通量测序，‘丰宁’和‘向阳’分别获得2.2×107和2.5×107条原始序列。唯一比对序列广泛分布于沙棘基因组中，并且在结构基因中的两端具有明显的富集。‘丰宁’和‘向阳’分别预测出1011和8670个peak，绘制了沙棘第一张H3K9ac修饰遗传图谱草图和鉴定出沙棘H3K9ac修饰所调控基因。‘丰宁’包含332个特异位点，‘向阳’包含4975个特异位点，195个位点同时存在于2个品种，特异位点所在区域的基因功能包括了代谢过程和细胞过程中多个生物学过程，响应干旱胁迫的ABA依赖途径和类黄酮途径可能同样被H3K9ac所调控，H3K9ac修饰位点为揭示品种间差异提供了新的表观遗传信息，为今后研究组蛋白修饰对沙棘基因表达的调控方式以及响应外界环境胁迫的基因表达奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1．1 研究背景

1．1．2 国内外研究现状

1．2 研究目标和主要研究内容

1．2．1 研究目标

1．2．2 研究内容

1．2．3 研究技术路线

第二章 土壤干旱对2个沙棘品种叶片水势和光合特性的影响

2．1 试验材料和方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验方法

2．1．3 测定指标及方法

2．1．4 统计分析

2．2 试验结果

2．2．1 土壤体积含水量的变化

2．2．2 不同程度干旱胁迫对两个沙棘品种植株叶片水势的影响

2．2．3 干旱胁迫对光合生理的影响

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 沙棘响应干旱胁迫的分子机制

3．1 试验材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 转录组数据组装结果

3．2．2 ‘丰宁'和‘向阳'响应干旱胁迫的差异基因表达分析

3．2．3 差异表达基因的GO功能注释

3．2．4 差异表达基因的KEGG通路富集分析

3．2．5 新基因的预测及功能注释

3．2．6 转录因子分析

3．2．7 沙棘响应干旱的分子机制

3．3 讨论

3．3．1 沙棘响应干旱胁迫的差异表达基因及其功能分析

3．3．2 沙棘响应干旱胁迫过程中新基因预测及转录因子分析

3．3．3 沙棘响应干旱胁迫的ABA依赖信号及类黄酮合成通路

3．4 小结

第四章 ‘丰宁’和‘向阳’品种H3K9乙酰化修饰图谱绘制及差异位点分析

4．1 试验材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 DNA片段化、H3K9ac与复合物的结合特性及片段富集

4．2．2 ‘丰宁’和‘向阳’沙棘H3K9ac修饰的全基因组分析

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 结论及展望

5．1 主要结论

5．1．1 土壤干旱对2个沙棘品种叶片水势和光合特性的影响

5．1．2 沙棘响应干旱胁迫的分子机制

5．1．3 2个沙棘品种H3K9乙酰化修饰图谱绘制及差异位点分析

5．2 展望

参考文献

在读期间的学术研究

致谢