MADS-box基因在水稻和太行花中的相关研究& SAGE在水稻上应用的生物信息学分析

摘要

本论文主要涉及两部分内容：第一部分是水稻和太行花中MADS-box基因的相关研究，第二部分是水稻中SAGE技术的生物信息学分析。
　　 MADS-box基因家族在花发育过程中起着重要的作用。水稻是单子叶植物的模式植物，其基因组序列的公布为在基因组水平上鉴定MADS-box基因提供了条件。根据已发表的水稻MADS-box基因序列，利用关键词搜索、HMMER分析、同源比较、系统进化树分析等手段，对GeneBank和TIGR水稻基因组注释中所有已知和未知的水稻MADS-box基因进行了分析。结果表明，水稻中有64个MADS-box基因编码不同氨基酸，其中已知cDNA序列的为43个。在64个基因中，有23个属于ABCDE类基因，并且其cDNA序列已知，其中的10个已有功能方面的研究。通过3'-RACE和筛选水稻花器官的cDNA文库，得到了一个A类基因片断(A5B2)，两个E类基因片断(MW1，MW2)。这三个基因分别与OsMADS14，OsMADS7和OsMADS5相似或相同。禾本科植物花器官的起源，尤其是内外稃的起源仍存在疑问，A功能基因是否以及如何参与其形成成为问题的关键。初步原位杂交分析表明，OsMADS14在花发育的早期开始表达。在小穗原基发育过程中，OsMADS14在内外稃原基中有较强的表达。随着小穗的发育，OsMADS14在整个花序中都有表达。在小穗发育的后期，OsMADS14在胚珠中有较强的表达。OsMADS14的表达模式与FUL类基因一致，并且证明了其在花发育的后期仍然表达强烈，暗示其可能与胚珠发育有重要关系。
　　 SEPALLATA基因被认为是花的特异因子，参与了花的四轮花器官的决定过程。在本文中，通过3'-，5'-RACE，从太行花花芽中克隆了一个MADS-box基因。该基因推导的的氨基酸序列含有典型的M，I，K和C四个结构域，与FBP2和SEP3的相似性较高，系统进化树分析表明该基因属于SEP3亚家族，于是将其命名为TrSEP3。TrSEP3首先在花分生组织中表达，然后在雌雄蕊原基及花瓣中表达；在成熟花中，TrSEP3仅在花瓣和雌蕊中表达。这种表达模式与其它的SEP-like基因有稍不同。TrSEP3拟南芥中过量表达后并未导致表型的改变，暗示其功能与拟南芥的SEP基因可能存在差异。选择压力分析显示TrSEP3受到了不显著的负选择压力。这些结果暗示TrSEP3的功能可能与其它的SEP-like基因有差别，值得进一步研究。
　　 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)是对比样品间转录谱的差异、发现新基因的有效的方法。tag mapping是将SAGE-tag与其转录本匹配的过程，其效率直接影响对转录谱的解释，该过程受多种因素影响。目前，对水稻tagmapping过程缺少详细研究，导致其效率不高。为了确定参考数据库和其它合适的条件，我们利用EST序列和基因组序列构建了不同的参考图谱，从全长cDNA数据库中提取虚拟的SAGE-tag，研究了参考图谱、锚定酶、tag长度以及匹配方法对tag mapping效率的影响，并比较了tag mapping的准确率。结果表明，用EST序列构建的参考图谱能够匹配大多数的SAGE-tag，并具有较高的准确率；利用迭代的方法，可以充分利用基因组序列。各种锚定酶之间的差别不明显，其中NlaⅢ，HpyCH4V和AluI表现较好；17bp的tag比较适合水稻；而用双锚定酶和17bp的tag则可以显著提高tag mapping的效率和准确率。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号缩写

第—章 水稻MADS-box基因的序列分析、基因克隆及初步的功能分析

前言

1、花发育研究进展

2、水稻花发育相关基因MADS-box研究进展

材料与方法

实验材料、药品

方法

结果与分析

1、水稻基因组水平MADS-box基因的检索与分析

2、cDNA文库的筛选

3、用3’-RACE克隆基因

4、OsMADS14基因的原位杂交分析

讨论

附录

第二章 太行花TrSEP3基因的克隆与功能分析

前言

材料与方法

实验材料、试剂

方法

结果与分析

1、序列的获得

2、序列分析

3、原位杂交分析

4、TrSEP3转化拟南芥的载体构建

5、TrSEP3正义载体转化拟南芥(过表达)

6、选择压力分析

讨论

附录

第三章 SAGE在水稻上应用的生物信息学分析

前言

数据与方法

虚拟SAGE库、参考数据库

锚定酶及tag长度的选择

tag的提取、匹配及匹配准确率的确定

结果与分析

1、参考数据库的构建

2、不同锚定酶在不同参考数据库中识别位点出现频率的比较

3、SAGE-tag长度对tag mapping的影响

4、锚定酶组合得到的17bp SAGE-tag在tag mapping中的效率分析

讨论

1、EST_U and EST_T是参考数据库的首选

2、双锚定酶和17bp的tag对水稻而言是理想的选择

参考文献

致谢