PAMAM树状化合物作为呼吸道合胞病毒基因疫苗递送载体的研究

摘要

DNA疫苗能刺激机体产生细胞免疫与体液免疫,其制造成本低廉,易于储存及运输。但是,裸DNA疫苗在体内传输过程中,很容易被酶水解,不能引起足够的免疫原性,很难达到好的免疫保护效果。DNA递送载体能够保护DNA分子不被酶水解。本课题选取聚酰胺-胺(PAMAM)树状化合物作为基因疫苗递送载体,通过细胞毒性实验及细胞凋亡实验研究了PAMAM G4及PAMAM G5在多种细胞系中的毒性,在此基础上初步探索了该树状化合物作为人呼吸道合胞病毒(Humanrespiratory syncytial virus,RSV)基因疫苗载体的在动物模型上应用。
　　 选取多个不同的电荷(N/P)比,制备PAMAM/DNA复合物,琼脂糖凝胶电泳结果表明,PAMAM G4及PAMAM G5都能够与DNA形成复合物。酶切保护实验结果表明,形成复合物后,DNA不被核酸酶降解,即PAMAM能够有效保护所携带的DNA分子不被降解。为进一步探索PAMAM的细胞毒性,分别选取了HEK293细胞、HepG2细胞、U251细胞及A549细胞进行毒性实验。结果表明,对于同种细胞系PAMAM G5的细胞毒性高于PAMAM G4的细胞毒性。PAMAMG448 h的半抑制率在0.1μg/μL,而PAMAM G548 h的半抑制率在0.05μg/μL。对于同一种PAMAM载体,随着浓度的增加毒性增大,细胞毒性呈现剂量依赖性。细胞凋亡实验结果表明,PAMAM在加入24 h后能够导致一些细胞坏死或晚期凋亡,早期凋亡现象不明显,同时,细胞坏死或晚期凋亡程度也呈现剂量依赖性,与MTT检测结果一致。在以上实验的基础上,选取N/P比为10:1作为免疫小鼠实验制备PAMAM/DNA复合物的标准。小鼠免疫实验初步结果表明经腿部肌肉注射PAMAM/DNA复合物,小鼠产生相应抗体。

目录

文摘

英文文摘

致谢

1.引言

1.1 DNA递送载体

1.2 新型的DNA递送载体PAMAM

1.3 PAMAM传递DNA原理

1.4 PAMAM用于体外转染及其毒性研究

1.5 DNA疫苗递送载体

1.6 本课题研究的目的与主要内容

2.实验材料与方法

2.1 质粒的制备与PAMAM/DNA复合物的表征

2.1.1 实验材料

2.1.2 pcDNA3.1/EGFP质粒的提取,纯化

2.1.3 pcDNA3.1/F质粒与酶切鉴定

2.1.4 PAMAM G4包裹pcDNA3.1/GFP与pcDNA3.1/F蛋白质粒梯度实验

2.1.5 PAMAM G5包裹pcDNA3.1/F蛋白质粒梯度实验

2.1.6 PAMAM G4的酶切保护实验

2.1.7 在不同电荷比下PAMAM G4与PAMAM G5酶切保护对比实验

2.2 PAMAM细胞毒性实验

2.2.1 材料与设备

2.2.2 细胞培养

2.2.3 PAMAM溶液制备

2.2.4 实验步骤

2.3 BALB/c小鼠免疫初步实验

2.3.1 DNA疫苗制备

2.3.2 操作步骤

2.3.3 体液中抗体浓度检测

3.实验结果

3.1 质粒的制备与PAMAM/DNA复合物的表征

3.1.1 pcDNA3.1/EGFP与pcDNA3.1/F鉴定实验结果

3.1.2 PAMAM G4包裹pcDNA3.1/EGFP与pcDNA3.1/F实验结果

3.1.3 PAMAMG5包裹pcDNA3.1/F蛋白质粒实验结果

3.1.4 酶切保护实验结果

3.1.5 PAMAM G4与PAMAM G5酶切保护对比与梯度实验结果

3.2 PAMAM细胞毒性实验

3.2.1 PAMAM G4与PAMAM G5对四种细胞系的毒性比较

3.2.2 细胞凋亡检测

3.3 小鼠免疫初步实验

4.讨论

4.1 PAMAM/DNA复合物的表征

4.2 细胞毒性实验

4.3 小鼠免疫预实验

5.结论

参考文献

附录 A 主要设备

附录 B 主要试剂与试剂盒

附录 C 主要试剂配制

附录 D 英文缩略词表

作者简历

学位论文数据集