水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建

摘要

水母雪莲(Saussurea medusa Maxim.)为多年生菊科植物，是我国珍稀药用资源。所含的主要生物活性成分是黄酮类物质，具有抗炎、镇痛、免疫抑制及抗氧化等功效。但由于水母雪莲生长环境特殊，生长缓慢，人工引种困难；加上长期掠夺性采挖，造成其野生药用资源短缺，已经不能满足市场的需求。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受关注，而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目。
　　 黄酮类化合物的合成代谢途径在植物界进化过程中很保守，黄酮类生物合成途径中的相关酶也已得到确证并进行了系统的研究。二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol-4-reductase，DFR)是一个处于花色素或者原花色素合成途径中的关键酶，它与黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase)竞争底物。本研究以水母雪莲为研究对象，根据近缘物种DFR基因的保守核苷酸序列设计兼并引物，通过PCR技术，从已经建立的水母雪莲红色愈伤组织cDNA文库中筛选到一个编码该酶的cDNA序列，该序列全长1166个碱基对。根据生物信息学分析，此cDNA编码342个氨基酸；Blastp分析结果显示，该氨基酸序列与同科植物翠菊(Callistephus chinensis)的相似性最高，达87％；SWISSMODEL软件预测其蛋白的三级结构与葡萄(Vitis vinifera)的十分相似，活性中心的关键氨基酸残基也完全一致。据此可以断定，我们所得到的cDNA为编码二氢黄酮醇还原酶的基因，并命名为水母雪莲二氢黄酮醇还原酶基因(SmDFR)。为了得到SmDFR的DNA序列，我们又设计特异引物，从水母雪莲的基因组中扩增出了由1871个碱基对组成的DNA序列，该序列包含五个内含子和六个外显子。
　　 为了提高水母雪莲和大苞雪莲中黄酮类物质的含量，我们构建了SmDFR的反义植物表达载体，利用根癌农杆菌介导进行基因转化。通过改变影响农杆菌转化的实验条件包括外植体来源、农杆菌菌株、细菌浓度、外植体预培养时间、侵染时间和乙酰丁香酮的浓度进行转基因试验，目前尚未得到转基因植株。另外，我们构建了SmDFR正义植物表达载体，通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana)DFR基因突变体和矮牵牛(Petunia hybrida)进行基因转化，来验证SmDFR的功能；目前，此实验尚在进行之中。

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论文说明：缩写词

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第一章 前言

1水母雪莲

1.1水母雪莲简介

1.2水母雪莲的化学成分及药理研究

1.3水母雪莲研究现状

2基因工程在药用植物中的应用

2.1农杆菌介导的基因转移

2.2基因调控技术

3二氢黄酮醇4-还原酶基因研究现状

3.1 DFR催化的反应及功能

3.2 DFR基因的表达调控研究

3.3 DFR对类黄酮代谢途径调控的研究

3.4本研究的目的、意义及技术路线

第二章 水母雪莲DFR基因的克隆及序列分析

第一节 引言

第二节 材料和方法

1实验材料及试剂

2实验方法

第三节 结果与讨论

1水母雪莲DFR基因cDNA序列的获得

2 DFR基因DNA序列的克隆

3水母雪莲DFR基因的cDNA序列、DNA序列及序列分析

4小结

5下一步上作

第三章 根癌农杆菌进行雪莲转基因的初步研究

第一节 引言

第二节 材料与方法

1实验材料及试剂

2实验方法

第三节 实验结果与讨论

1水母雪莲二氢黄酮醇还原酶基因正义和反义真核表达载体的构建

2表达载体的分子鉴定

3雪莲组培苗及根的转染

4雪莲转基因不成功可能存在的原因

5小结

6目前的工作及展望

参考文献

附录

致谢

个人简历