构建人呼吸道合胞病毒反基因组cDNA及其拯救尝试

摘要

目的：通过RNA反向遗传学操作，克隆人呼吸道合胞病毒(human respiratorysyncytial virus，RSV)反基因组cDNA，并构建以T7 RNA多聚酶(T7 RNApolymerase，T7 RNP)为启动子、插入有绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecentprotein，EGFP)的RSV反基因组cDNA重组质粒pBRAT-RSV-EGFP，通过MVA-T7痘苗病毒等提供T7 RNP，探讨拯救可表达EGFP的重组人呼吸道合胞病毒(rRSVEGFP)的条件。
　　方法：利用分子病毒学和分子生物学技术，以经过改造的pBR322质粒为克隆载体，通过多步克隆操作，获得编码RSV反基因组的cDNA克隆，并且将EGFP表达盒插入到RSV反基因组cDNA中，构建重组RSV反基因组质粒pBRAT-RSV-EGFP。克隆的反基因组cDNA位于T7启动子下游和丁肝核酶（HDV ribozyme，δ）以及T7转录终止信号的上游，经核酸内切酶及核酸序列分析后，分别用MVA-T7病毒、BSR T7/5细胞和pcDNA3.1-T7RNP质粒提供T7 RNP，同时转染pBRAT-RSV-EGFP，经转录获得重组RSV单股正链的反基因组，以可表达四种RSV核衣壳蛋白或多聚酶蛋白的质粒pcDNA3.1-N-OPT、pcDNA3.1-P-OPT、pcDNA3.1-M2-1-OPT和pcDNA3.1-L-OPT为辅助质粒，并共转染至BSR T7/5细胞或瞬时表达T7 RNP的HEp-2拯救rRSV/EGFP，观察绿色荧光表达情况评估拯救的条件。
　　结果：经核酸内切酶及核酸序列分析证实，RSV反基因组cDNA及插入有EGFP的RSV反基因组cDNA克隆及其重组质粒均成功获得。与BSR T7/5细胞和pcDNA3.1-T7RNP质粒相比，以MVA-T7感染HEp-2细胞，能够高效提供T7 RNP，是用于重组RSV拯救的有效方法。
　　结论：成功克隆及构建了可表达EGFP的RSV反基因组cDNA及其重组质粒，并对拯救体系进行了比较研究，这些工作为最终实现重组RSV的成功拯救提供了有益的经验。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言

2 实验材料

2．1 细胞、载体、感受态细胞和病毒

2．2 工具酶与试剂盒

2．3 主要生化试剂

2．4 主要实验仪器

2．5 主要溶液配制

3 实验方法

3．1 细胞培养

3．2 感受态细胞的制备

3．3 EGFP基因的获得与鉴定

3．3．1 EGFP基因的PCR扩增

3．3．2 PCR产物的胶回收

3．3．3 PCR产物加A尾及纯化

3．3．4 T载体连接及转化

3．3．5 质粒的提取及鉴定

3．4 RSV反基因组cDNA的分段克隆

3．5 SH基因的改造

3．6 pBRAT质粒的构建及鉴定

3．6．1 DNA连接子的获得

3．6．2 酶切pBR322载体并回收

3．6．3 pBRAT质粒的连接及鉴定

3．7 携带EGFP基因的RSV反基因组质粒的构建及鉴定

3．7．1 携带EGFP基因的RSV反基因组质粒的构建

3．7．2 携带EGFP基因的RSV反基因组质粒的鉴定

3．8 MVA-T7病毒培养与鉴定

3．8．1 MVA-T7病毒的培养

3．8．2 免疫酶法测定MVA-T7病毒的滴度

3．9 重组RSV病毒的拯救

3．9．1 MVA-T7拯救重组RSV病毒

3．9．2 用质粒提供T7 RNP拯救重组RSV病毒

3．9．3 用BSR T7／5细胞拯救重组RSV病毒

4 实验结果

4．1 质粒和病毒的鉴定

4．1．1 RSV反基因组cDNA各片段克隆质粒及pBRAT载体的鉴定

4．1．2 SH基因改造的鉴定

4．1．3 携带EGFP基因的重组RSV反基因组质粒的鉴定

4．1．4 MVA-T7病毒的滴度

4．2 MVA-T7拯救重组RSV病毒

4．3 用质粒提供T7 RNP拯救重组RSV病毒

4．4 用BSR T7／5细胞拯救重组RSV病毒

4．5 重组RSV基因组核酸序列分析

5 讨论

6 结论

参考文献

附录

硕士期间发表论文情况

作者简历

学位论文数据集