人骨髓间充质干细胞介导的肝细胞生长因子拮抗剂NK4地肝癌的体外抑制作用研究

摘要

目的:间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)作为重要的成体干细胞之一，免疫原性低，在体内能够向肿瘤迁移、定位，并整合入肿瘤的结缔组织中。干细胞治疗是目前正在探索的肿瘤新型生物治疗方法之一，以MSCs作为抗肿瘤因子的递送载体用于肿瘤治疗的尝试已取得一定进展。肝细胞生长因子拮抗剂NK4具有拮抗肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）诱导的肿瘤生长、转移和侵袭以及抑制非HGF/c-Met依赖性的肿瘤血管生成的双重作用，作为抗肿瘤制剂具有良好的应用前景。目前常用腺病毒作为递送载体介导其发挥抗肿瘤作用，以MSCs为递送载体可以避免腺病毒载体直接递送基因反复应用引起的免疫排斥反应。本实验拟通过体外实验研究人骨髓MSCs向人高转移肝癌细胞系MHCC-97H的迁移特性以及通过重组腺病毒载体(recombinant adenoviral vector,rAd)介导NK4修饰的人骨髓MSCs对MHCC-97H细胞增殖和转移的抑制作用及其机制。
　　方法:通过transwell将MSCs与MHCC-97H共培养，分析MSCs体外向肝癌细胞MHCC-97H的迁移性。以pCR-4-TOPO-HGF为模板，PCR扩增获得NK4基因，然后克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV，再经同源重组获得重组腺病毒质粒，293细胞包装，获得重组腺病毒rAd-NK4/GFP，用TCID50法测定病毒滴度，提取病毒基因组PCR鉴定目的基因，Western-blot鉴定目的基因表达;用高滴度的腺病毒rAd-NK4/GFP感染MSCs，获得带有NK4的MSCs(rAd-NK4-MSCs)，将rAd-NK4-MSCs与MHCC-97H以1∶1的比例通过transwell进行共培养，分别在24h、48 h、72 h用MTT法检测rAd-NK4-MSCs对MHCC-97H细胞增殖的抑制作用，在24 h后用结晶紫染色法检测rAd-NK4-MSCs对MHCC-97H细胞转移的抑制作用。为了探究rAd-NK4-MSCs对MHCC-97H增殖和转移的抑制机制，应用Western-blot检测MHCC-97H与rAd-NK4-MSCs共培养后MHCC-97H细胞HGF/c-Met信号通路关键因子ERK1/2磷酸化水平变化。为了进一步探究rAd-NK4-MSCs也可以通过抑制血管生成来抑制肿瘤生长，利用细胞划痕实验检测了rAd-NK4-MSCs条件培养基对人脐带血管内皮细胞(HUVECs)体外转移的抑制作用。
　　结果:MSCs迁移实验结果表明，体外MSCs具有显著的向MHCC-97H细胞的迁移性(P＜0.01)。在构建重组腺病毒实验中，重组腺病毒DNA分子转染293细胞后，10d左右细胞出现肿胀、圆缩等典型的病变效应（Cytopathic effect，CPE），提取病毒基因组后PCR检测到目的条带，Western-blot检测到NK4基因的表达，扩增后得到高滴度(0.8×1010 pfu/mL)、有活性的非复制型重组腺病毒rAd-NK4/GFP，并成功感染MSCs。体外共培养实验中，MTT结果表明，在24 h、48 h、72 h时rAd-NK4-MSCs均能显著抑制MHCC-97H细胞的体外增殖(P＜0.05)，抑制率随着时间的延长而增大;结晶紫染色实验结果表明，rAd-NK4-MSCs显著抑制了MHCC-97H细胞的体外迁移能力(P＜0.01); Western-blot检测到ERK1/2磷酸化水平下调。HUVECs体外迁移抑制实验中，rAd-NK4-MSCs条件培养基显著抑制了HUVECs的体外迁移(P＜0.01)。
　　结论:本实验通过体外实验明确了人骨髓MSCs向肝癌细胞的迁移特性以及通过腺病毒介导NK4修饰的人骨髓MSCs对肝癌细胞生长和转移的抑制作用及其机制，为以MSCs为细胞载体携带NK4基因靶向治疗肝癌的临床应用提供了实验依据。

目录

声明

致谢

摘要

1 引言

1．1 肝癌

1．2 间充质干细胞

1．2．1 MSCs概况

1．2．2 MSCs成为肿瘤基因治疗的优势载体

1．3 NK4的抗肿瘤作用

1．3．1 NK4的结构特性

1．3．2 NK4抑制肿瘤血管生成

1．3．3 NK4基因靶向抗肿瘤作用

1．3．4 NK4的抗肿瘤机制

1．4 本研究的特色

2 实验材料

2．1 细胞株及细胞培养所用试剂

2．1．1 细胞株

2．1．2 培养基

2．2 毒株、载体与宿主菌

2．3 主要试剂及试剂盒

2．4 主要实验仪器及耗材

2．5 主要溶液的配制

2．5．1 核酸电泳缓冲液的配制

2．5．2 蛋白质电泳所用试剂及缓冲液的配制

2．5．3 细胞培养所用试剂配制

3 实验方法

3．1 MSCs的准备

3．1．1 MSCs的复苏和培养

3．1．2 MSCs的传代

3．1．3 MSCs的冻存

3．2 人高转移性肝癌细胞MHCC-97H和人胚肾细胞HEK293

3．2．1 MHCC-97H和HEK293的复苏

3．2．2 MHCC-97H和HEK293的培养

3．2．3 MHCC-97H和HEK293的冻存

3．3 MSCs迁移实验

3．4 重组腺病毒的获得

3．4．1 目的基因的获得

3．4．2 重组穿梭质粒pAdTrack-NK4的构建

3．4．3 连接产物转化E．coli DH5α感受态细胞

3．4．4 提取和鉴定重组穿梭质粒pAdTrack-NK4

3．4．5 重组腺病毒质粒pAdeasy-NK4的的获得

3．4．6 重组腺病毒的包装，收毒及扩增

3．4．7 PCR鉴定重组腺病毒

3．4．8 Western blot分析目的蛋白表达情况

3．5 rAd-NK4-MSCs对MHCC-97H增殖和转移的体外抑制及其机制

3．5．1 重组腺病毒rAd-NK4／GFP感染MSCs的最适MOI及蛋白表达时间的确定

3．5．2 共培养检测rAd-NK4-MSCs对MHCC-97H增殖的抑制作用

3．5．3 共培养检测rAd-NK4-MSCs对MHCC-97H转移的抑制作用

3．5．4 rAd-NK4-MSCs对MHCC-97H转移的抑制作用机制

3．6 rAd-NK4-MSCs条件培养基作用的HUVECs的细胞划痕实验

4．实验结果

4．1 迁移实验

4．2 高滴度有活性的重组腺病毒rAd-NK4／GFP的获得

4．2．1 NK4基因的获得

4．2．2 重组穿梭质粒的构建与鉴定

4．2．3 在RecA+E．coli BJ5183细胞中同源重组

4．2．4 将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞获得重组腺病毒

4．2．5 重组腺病毒rAd-NK4／GFP的鉴定

4．2．6 重组腺病毒rAd-NK4／GFP的扩增与滴度测定

4．3 MSCs介导的NK4对MHCC-97H细胞生长和转移的抑制作用

4．3．1 重组腺病毒rAd-NK4／GFP感染MSCs的最适MOI及蛋白表达时间的确定

4．3．2 MSCs介导的NK4对MHCC-97H细胞的体外增殖抑制效应

4．3．3 MSCs介导的NK4体外对MHCC-97H细胞转移的抑制作用及其机制

4．4 MSCs介导的NK4体外对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)迁移的抑制作用

5 讨论

6 结论

参考文献

附录

作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果

学位论文数据集