EGDE交联血红蛋白制备红细胞代用品

摘要

研究将乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)作为蛋白质交联剂,用来交联血红蛋白(Hb),制备红细胞代用品.探索了这一交联反应的可行性,优化了交联条件.该文还发展了一种活性基团干扰法,间接测定出EGDE在pH7.5下,主要作用基团为血红蛋白的巯基,在pH8.7和9.5的条件下,主要作用基团为血红蛋白的氨基.采用SDS-PAGE电泳、高效液相色谱和多角度激光散射联用法检测交联反应结果.实验表明,不同的反应条件下可得到不同的反应产物,在35℃、pH8.7、较低的血红蛋白浓度(20mg/ml)和相对较高的修饰剂比例(摩尔比EGDE:Hb=100:1)下反应4小时,主要产物为分子内部亚基之间交联的血红蛋白,且分子内交联血红蛋白相对总蛋白含量90％以上;在pH7.5、较高的血红蛋白浓度(200mg/ml)和相对较低的修饰剂比例(摩尔比EGDE:Hb=25:1)下反应12小时,主要产物为分子间交联寡聚血红蛋白,分子量范围在140-380KD之间,其中二聚体血红蛋白占总蛋白量的74.7％,三聚体血红蛋白18.9％,四到六聚血红蛋白6.4％,几乎无高聚物生成,是红细胞代用品的最佳分子量.小鼠的安全性实验表明产品无毒性,论证了其作为红细胞代用品的生物安全性.进一步研究了EGDE分子内交联血红蛋白和分子间交联寡聚血红蛋白各种性质,包括携氧特性、等电点、交联特性、全波长扫描分析、蛋白质二级结构分析等,探讨了其作为红细胞代用品的可行性.

目录

文摘

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北京化工大学学位论文原创性声明

第一章文献综述

1.1血红蛋白的结构与功能

1.1.1血红蛋白的结构

1.1.2血红蛋白的生理功能

1.1.3影响血红蛋白对氧亲合力的因素

1.1.4天然血红蛋白直接作为血液代用品的缺陷

1.2基于血红蛋白的血液代用品

1.2.1第一代修饰血红蛋白血液代用品

1.2.2第二代修饰血红蛋白血液代用品

1.2.3第三代血液代用品

1.3本课题设计思想

1.3.1现有临床第一代血液代用品的缺陷

1.3.2现有的蛋白质交联的双功能试剂

1.3.3交联方法的选择

1.3.4 EGDE交联血红蛋白制备红细胞代用品

第二章EGDE交联血红蛋白制备条件优化

2.1材料与方法

2.1.1实验药品及设备（参见附录一）

2.1.2牛血红蛋白的制备

2.1.3 EGDE交联血红蛋白制备条件优化

2.1.4 EGDE交联血红蛋白交联度的检测方法

2.2结果与讨论

2.2.1温度对血红蛋白交联的影响

2.2.2 pH对血红蛋白交联的影响

2.2.3 EGDE与血红蛋白的配比对交联的影响

2.2.4浓度对血红蛋白交联的影响

2.2.5时间对血红蛋白交联的影响

2.3小结

第三章EGDE与血红蛋白交联反应机理探讨

3.1材料与方法

3.1.1实验药品及设备（参考见附录一）

3.1.2牛血红蛋白的制备（参见第二章2.1.2）

3.1.3实验方法

3.1.4分析方法

3.2结果与讨论

3.2.1 SDS-PAGE电泳检测交联度分析EGDE与血红蛋白的作用基团

3.2.2荧光胺法测定氨基修饰度

3.3小结

第四章EGDE分子内交联血红蛋白和分子间交联寡聚血红蛋白的制备

4.1材料与方法

4.1.1实验药品及设备(参见附录一)

4.1.2牛血红蛋白的制备(参见第二章2.1.2)

4.1.3实验方法

4.1.4分析方法

4.2结果与讨论

4.2.1 SDS-PAGE电泳检测交联程度

4.2.2高效液相TSK 3000SW凝胶过滤检测分子量

4.2.3多角度激光检测分子量

4.3小结

第五章EGDE交联血红蛋白的性质鉴定

5.1材料与方法

5.1.1实验药品及设备(参见附录一)

5.1.2牛血红蛋白的制备(参见第二章2.1.2)

5.1.3 EGDE交联血红蛋白和DBBF交联血红蛋白的制备(参见第四章4.1.3)

5.1.4实验和分析方法

5.2结果与讨论

5.2.1 EGDE交联血红蛋白生物活性(P50和Hill系数)测定

5.2.2 EGDE交联血红蛋白的等电点的测定

5.2.3 EGDE交联血红蛋白的抗解聚特性

5.2.4 RP-HPLC-MS联用检测EGDE交联血红蛋白的亚基交联状况

5.2.5 EGDE交联血红蛋白的全波长分析

5.2.6傅立叶变换红外光谱分析

5.2.7 EGDE交联血红蛋白的生物安全性鉴定

5.3小结

第六章结论与创新点

第七章问题与建议

参考文献

附录一实验药品及设备

研究期间申请专利和发表论文

致谢