快速型重组人胰岛素及C肽的研究

摘要

胰岛素是治疗糖尿病的特效药物，C肽是胰岛素A链和B链之间的连接肽。在研究胰岛素的结构和生物功能的关系中，过去人们一直认为C肽无生物活性，仅在胰岛素二硫键正确配对时起作用，但近年很多研究肯定C肽具有多种生物学作用。 表达重组人胰岛素及C肽的毕赤酵母菌株构建由本实验室完成。本文利用已构建好的菌株，对分泌表达、高密度发酵和纯化工艺进行研究，得到重组人胰岛素原类似物，经酶切后获得重组人胰岛素及C肽。 在论文中，考察了不同配方的三种培养基，找出了最适合本菌株生长的培养基；同时对影响分泌表达的发酵条件和诱导条件进行优化，当诱导pH为5、甲醇浓度保持在1％以及(NH4)2SO4浓度9g/L、PTM添加量2mL/L、甘油浓度40g/L时，目的蛋白产量最大。多次10L发酵罐放大实验中，目的蛋白产量是摇瓶培养的1.5-2倍。 用中空纤维膜超滤截流目的蛋白，可除掉50％以上的杂蛋白，同时还可以对发酵液进行除盐和初步浓缩，最终收率基本保持在30％～50％之间，并且对活性无破坏；文中还对SPSepharoseFastFlow强阳离子交换柱、CMSepharoseFastFlow弱阳离子交换柱、DEAE-SepharoseFastFlow弱阴离子交换柱对目的蛋白的吸附进行考察，确定了每种交换柱的最适pH值及洗脱NaCl浓度；其中SP-FF阳离子交换柱吸附目的蛋白效果最好，当缓冲液pH3.5、洗脱NaCl浓度在0.2mol/L时得到目的蛋白纯度最高。 经过SP-FF柱层析分离得到的目的蛋白，经Westernblot印迹分析目的蛋白具有免疫活性；经Lys-C酶和羧肽酶B两步酶切后得到了具有生物活性的人胰岛素和C肽。C肽样品经酶联免疫法检测，其浓度水平为10ng/ml(3.31nmol/L)。

目录

文摘

英文文摘

北京化工大学位论文原创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章文献综述

第三章菌种筛选与培养

第四章发酵工艺确定

第六章分离纯化工艺的研究

第五章酶切及产物后分离

第六章结论

参考文献

附录

致谢

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