酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达研究

摘要

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是生物体内重要的中间代谢物质，参与了40多种生化反应，从基因的表达，细胞膜的流动到多肽的合成等等。临床研究表明，SAM对关节炎，抑郁症，肝功能紊乱等均有较好的疗效，而且还是预防癌症，心血管疾病和抗衰老的高级保健药物。我国肝炎患者相当多，且随着生活节奏的增快，抑郁症和关节炎患者也不断增多，S-腺苷甲硫氨酸在国内存在广阔的市场。而至今国内S-腺苷甲硫氨酸的研究还没有工业化，虽然有国外商品供应，但价格昂贵无法普及。因此国内开发高产廉价的S-腺苷甲硫氨酸生产工艺显得极为迫切。
　　 本论文完成了酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(sam2)的克隆及原核表达。以酿酒酵母2B-41的染色体DNA为模板，根据GenBank上登陆的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(登录号M23368)设计特异性引物进行PCR扩增，获得大约1200bp的DNA片段。通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆到pUCm-T载体中，构建重组质粒pUCm-T-sam2，转化E.coli DH5α，经蓝白斑筛选、菌落PCR及质粒的双酶切筛选出2个阳性克隆。选取一个阳性克隆测序，并用Blast软件进行序列分析。分析结果表明，该序列与Genbank中登录的sam2基因同源性为99％，氨基酸序列一致性为100％。
　　 以EcoR I/XhoI双酶切经测序正确的重组质粒pUCm-T-sam2和表达载体pET-28a(+)，并将纯化后的sam2连接至pET-28a(+)，构建表达载体pET-sam2。将pET-sam2转化E.coli BL21(DE3)。重组菌经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测表达外源蛋白分子量约为47KD，与预期分子量相符。同时研究了不同IPTG浓度、不同诱导温度对蛋白表达水平的影响，发现IPTG浓度对SAM的表达量影响不大，低温不利于表达。测定酶活为0.0237U/mL。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章 绪论

1.1 S-腺苷甲硫氨酸的生理功能

1.1.1 S-腺苷甲硫氨酸在体内的代谢循环

1.1.2 S-腺苷甲硫氨酸的生理功能

1.2 S-腺苷甲硫氨酸的应用

1.3 S-腺苷甲硫氨酸生产的研究历史及现状

1.3.1 S-腺苷甲硫氨酸生产工艺的研究

1.3.2 S-腺苷甲硫氨酸稳定性研究

1.3.3 S-腺苷甲硫氨酸的提取、分离纯化及测定

1.4论文的立题背景及研究内容

第二章 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆

2.1实验材料

2.1.1实验仪器

2.1.2载体与菌株

2.1.3酶及主要试剂

2.1.4培养基

2.2实验方法

2.2.1酿酒酵母基因组DNA的提取

2.2.2琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA

2.2.3 PCR扩增目的基因sam2

2.2.4重组载体pUCm-T-sam2构建及转化

2.3结果与讨论

2.3.1基因组DNA的提取

2.3.2 PCR反应

2.3.3菌落PCR筛选阳性克隆

2.3.4阳性克隆的酶切鉴定

2.3.5目的基因序列测定及结果分析

2.4小结

第三章 SAM合成酶基因表达载体的构建及表达

3.1实验材料

3.1.1实验仪器

3.1.2载体及试剂

3.2实验方法

3.2.1表达载体pET-sam2的构建及转化

3.2.2 sam2的诱导表达

3.2.3 SAM合成酶酶活的测定

3.3结果与讨论

3.3.1 PCR初步筛选阳性菌株

3.3.2阳性克隆的酶切鉴定

3.3.3诱导时间对表达量的影响

3.3.4 IPTG浓度对表达量的影响

3.3.5温度对表达量的影响

3.3.6 SAM合成酶酶活测定结果

3.4小结

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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