重组青霉素G酰化酶在大肠杆菌中的表达及其固定化

摘要

6-氨基青霉烷酸(6-APA)是合成β-内酰胺类抗生素的重要母核，酶法生产6-APA由于其反应条件温和、污染少、转化率高等特点，成了人们争相研究的热点。在酶法生长6-APA的工艺中，青霉素G酰化酶是其中关键的催化用酶。 本文通过PCR方法成功扩增到大肠杆菌ATCC11105来源的PGA基因，全序列包括信号肽、α亚基、连接肽和β亚基。 利用基因工程手段，将不同启动子序列与PGA基因进行搭接并构建重组质粒。通过比较不同启动子对菌体生长以及PGA表达的影响，发现以tac为启动子时，PGA酶活水平较高，表达过程不受IPTG以及苯乙酸诱导。 将重组质粒pGEMKT-TacPGA转化至不同基因型的大肠杆菌中发现，大肠杆菌Top10F’是较优的表达菌株，因为其生长迅速，相同培养基和培养条件下单位菌液体积酶活较高，适合大规模培养生产。 以E．coli Trop10F’/pGEMKT-TacPGA为出发菌株，继续优化培养条件以及培养基组成。将重组菌体接种到含90ml培养基的150ml三角瓶中，28℃培养30h以上，PGA酶活水平可达1400U/L。 在成功构建pGEMKT-TacPGA的基础上，利用基因工程手段在PGA基因的3'端引入特殊标签序列(Tag)，构建PGA的另一个表达质粒pGEMKT-TacPGA-Tag。PGA的C末端带有一段融合蛋白，可以通过金属螯和作用特异性地与载体上地Ni<'2+>结合，PGA蛋白在获得纯化的同时，被固定到载体上。固定化酶活为每克载体有75U单位。将载体直接应用于青霉素G的催化实验，在连续催化9批过程中，固定化酶表现出了很好的稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1青霉素类抗生素

1.1.1基本结构

1.1.2抑菌机理

1.1.3青霉素类抗生素的市场

1.2半合成类抗生素

1.3 6-氨基青霉烷酸

1.3.1概述

1.3.2 6-APA的合成

1.4青霉素酰化酶

1.4.1青霉素酰化酶的分类

1.4.2青霉素G酰化酶的来源及结构

1.4.3青霉素G酰化酶的表达

1.4.4青霉素G酰化酶的研究进展

1.5在大肠杆菌中高效可溶性表达外源蛋白的策略

1.5.1大肠杆菌表达系统

1.5.2大肠杆菌表达载体的构成

1.5.3大肠杆菌组成型表达系统

1.5.4重组菌的高密度培养

1.5.5大肠杆菌的培养与诱导方法

1.6固定化金属螯和层析(IMAC)

1.6.1基本原理

1.6.2金属螯合载体的构成

1.6.3 IMAC的应用

1.7论文的目的和意义

1.7.1论文的目的

1.7.2论文的创新点

1.8论文的研究内容

第二章材料与方法

2.1本章引论

2.2材料

2.2.1菌种和质粒

2.2.2仪器、试剂盒、工具酶、化学试剂

2.2.3培养基

2.2.4抗生素、诱导剂

2.2.5缓冲液

2.3分子生物学于生物化学操作方法

2.4菌种培养与保存

2.5细胞破碎方法

2.6葡萄糖浓度测定方法

2.7青霉素G酰化酶活力测定

2.7.1比色分析法

2.7.2高效毛细管电泳分析方法

第三章重组青霉素G酰化酶的组成型表达

3.1本章引论

3.2材料和方法

3.2.1质粒与菌株

3.2.2工具酶与试剂盒

3.2.3启动子的选择

3.3青霉素G酰化酶组成型表达质粒的构建

3.3.1构建思路

3.3.2 PCR扩增tac启动子、pga基因以及TacPGA大片段

3.3.3双酶切反应

3.3.4连接与转化

3.3.5质粒快速鉴定筛选重组菌株

3.3.6重组菌的酶活筛选

3.4三种启动子对PGA表达的影响

3.5宿主的更换

3.6本章小结

3.7讨论

第四章重组菌株TFpGTacPGA培养条件的优化与发酵罐培养

4.1本章引言

4.2材料与方法

4.2.1培养基与化学试剂

4.2.2培养条件

4.2.3分析方法

4.3培养条件的优化

4.3.1温度的优化

4.3.2摇瓶培养中装液量的优化

4.3.3培养基初始pH的优化

4.4培养基组成的优化

4.4.1酵母粉浓度优化

4.4.2初始葡萄糖浓度的优化

4.4.3玉米浆在摇瓶培养中的应用

4.4.4无机氮源的优化

4.5青霉素G酰化酶重组菌发酵的过程分析

4.6重组菌株TFpGTacPGA的发酵罐培养

4.7本章小节

4.8讨论

第五章一步纯化、固定化青霉素G酰化酶的初步研究

5.1本章引论

5.2材料和方法

5.2.1质粒与菌株

5.2.2工具酶与试剂盒

5.2.3培养基

5.2.4载体

5.3固定化研究所用重组质粒的构建

5.3.1构建思路

5.3.2 PCR扩增P-Tag293片段

5.3.3单酶切反应

5.3.4连接与转化

5.3.5转化子的筛选

5.3.6更换宿主

5.4固定化酶催化批次研究

5.4.1实验装置

5.4.2固定化酶制备过程

5.4.3青霉素G酰化酶的纯化

5.4.4固定化酶的酶活测定

5.4.5固定化酶的催化批次

5.5本章小节

5.6讨论

结论

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介