外来入侵植物黄顶菊中活性成分的分离分析、结构鉴定及活性研究

摘要

外来入侵植物黄顶菊是我国危害最为严重的恶性杂草之一，具有发生量大、繁殖迅速、传播速度快的特点。相比简单的防治方法，资源化利用黄顶菊具有更大优势。为综合防控黄顶菊，开发和利用其巨大的生物资源，需对黄项菊的活性成分进行深入细致的研究。活性成分的分离纯化是关键。逆流色谱（Counter-currentchromatography，CCC）是近几十年发展起来一种连续有效的液液分配色谱技术，它不使用固态支撑体或载体，从而避免了不可逆吸附造成的化学变性及失活等问题，具有样品回收率高，重现性好，溶剂消耗量少，洗脱方式多样等优点。近年来一系列逆流色谱新方法及新仪器的研发，改进了逆流装置，扩展了逆流色谱的应用范围，提高了逆流色谱的分离效率。因此广泛应用于天然产物中有效成分的分离和纯化。本论文主要采用逆流色谱法分离纯化黄顶菊中的活性物质。
　　 本论文系统的研究了外来入侵植物黄顶菊中活性物质的分析方法和分离提纯方法。建立了黄顶菊活性物质的回流粗提工艺;建立了逆流色谱分离纯化黄顶菊中活性物质单体的方法，实现了黄顶菊中活性物质十种单体的分离纯化及结构鉴定;建立了高效液相色谱法定量分析黄顶菊中主要活性物质单体的方法和黄顶菊叶的高效液相色谱指纹图谱;初步评价了从黄项菊中分离得到的主要黄酮类物质的抗氧化活性。主要研究成果如下:
　　 1.通过单因素和正交实验确定了黄顶菊总黄酮最佳提取工艺:80％乙醇，料液比1∶30(w/v)，每次回流75min，回流2次。应用最优提取工艺分别提取不同部位，不同生长期，不同地区黄顶菊样品，并测定其总黄酮含量。黄顶菊中黄酮类化合物含量较高的的部位是花部和叶部，含量较高的生长期是开花期，河北省采集的黄顶菊叶中总黄酮含量较其它地区的高。
　　 2.使用逆流色谱和制备液相色谱分离纯化了黄顶菊中四种主要的黄酮苷，并通过ESI-MS，1HNMR，13CNMR，HSQC和HMBC等方法进行了结构鉴定。对比了高速逆流色谱(HSCCC)与高效逆流色谱（HPCCC）的分离效率，研究了洗脱-推出逆流色谱法(EECCC)分离黄顶菊粗提物的方法。使用GS10AB-A型HSCCC仪，乙酸乙酯-甲醇-水(25∶1∶25，v/v)体系，一次可分离约400mg黄顶菊粗品，得到3.6mg纯度97％以上的万寿菊素-3-O-葡萄糖苷，4.4mg纯度98％以上的紫云英苷以及4.2mg纯度97％以上的异槲皮苷和6-甲氧基山奈酚-3-O-葡萄糖苷的混合物，采用制备高效液相色谱法进一步将两种物质分离。采用HSCCC二氯甲烷-甲醇-水(5∶3∶2，v/v)体系，从逆流分离黄酮苷回收样品中分离出高纯度的四种黄酮醇。研究结果表明逆流色谱是一种从黄顶菊中分离活性物质的有效手段。
　　 3.采用逆流色谱两种溶剂系统从黄顶菊中分离纯化了异鼠李素-3-硫酸酯，并鉴定结构。相比传统的多组分有机溶剂-水体系，单组分有机溶剂-盐水体系更适合极性物质异鼠李素-3-硫酸酯的分离。采用正丁醇-0.25％NaCl(1∶1，v/v)溶剂体系，一次HSCCC实验可从约400mg未经任何前处理的黄顶菊粗品中分离纯化出2.1mg纯度大于97％的异鼠李素-3-硫酸酯。研究结果表明单组份有机溶剂-盐水逆流色谱体系特别适合制备分离大极性物质异鼠李素-3-硫酸酯。
　　 4.建立了一种简单灵敏的HPLC-DAD同时测定黄顶菊样品中六种主要物质含量的方法，并进行了方法学考察。测定了不同部位，不同生长期，不同地区黄顶菊样品中活性物质的含量，明确了其动态变化规律。首次建立了黄顶菊叶的HPLC指纹图谱，评估和鉴别了十二批来自中国四个不同地区的黄项菊叶样品，并计算其相似度。将HPLC指纹图谱研究和主成分含量测定结合在一起，可以为黄顶菊的物种鉴别提供化学依据。
　　 5.将黄顶菊中含量最高的黄酮苷紫云英苷研制成国家标准样品，资源化利用黄顶菊。采用连续进样逆流色谱法大量制备分离了黄顶菊中的紫云英苷，并进行了多种手段的结构确证以及HPLC纯度检查。对其进行了均匀性与稳定性考察，均符合标准样品要求，最后通过多家实验室共同定值，确定紫云英苷标准样品纯度定值结果为98.49％。
　　 6.对黄顶菊中分离得到的五种主要黄酮类物质进行初步抗氧化性研究，评价了其清除DPPH自由基，总抗氧化能力T-AOC，清除超氧阴离子自由基和羟自由基的能力。结果表明五种物质均具有一定的自由基清除能力和抗氧化能力，为综合开发利用黄顶菊为天然抗氧化剂提供基础。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 黄顶菊研究进展

1．1．1 黄顶菊简介

1．1．2 黄顶菊及黄顶菊变种中的次生代谢物质

1．1．3 黄顶菊中次生代谢物质的生物活性

1．1．4 黄顶菊中活性物质的分离提取及分析方法

1．2 逆流色谱

1．2．1 逆流色谱简介

1．2．2 逆流色谱原理

1．2．3 逆流色谱溶剂系统的选择

1．2．4 逆流色谱的洗脱模式

1．2．5 逆流色谱新仪器——高效逆流色谱(High-performance counter-current chromatography,HPCCC)

1．2．6 pH区带精制逆流色谱

1．2．7 逆流色谱在天然产物分离纯化中的应用

1．3 指纹图谱

1．3．1 指纹图谱简介

1．3．2 高效液相色谱(HPLC)指纹图谱

1．4 选题目的和主要研究内容

第二章 黄顶菊粗提工艺的研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验材料、试剂及仪器

2．2．2 黄顶菊样品的处理及回流粗提实验

2．2．3 紫外可见分光光度法测定黄顶菊提取液中总黄酮的含量

2．2．4 黄顶菊中总黄酮提取工艺的研究

2．2．5 不同部位不同生长期不同地区黄顶菊总黄酮含量的测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 紫外可见分光光度法检测波长的选择

2．3．2 芦丁标准曲线的建立

2．3．3 黄顶菊中总黄酮提取工艺的确定

2．3．4 不同部位不同生长期不同地区黄顶菊中总黄酮含量的测定

2．4 小结

第三章 黄顶菊中黄酮苷和黄酮醇的分离纯化及结构鉴定

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器

3．2．2 材料和试剂

3．2．3 黄顶菊粗提物的制备

3．2．4 逆流色谱两相溶剂系统、样品溶液的准备及分配系数的测定

3．2．5 高速逆流色谱(HSCCC)及高效逆流色谱(HPCCC)分离过程

3．2．6 分析型高效液相色谱(HPLC)分析粗提物及逆流分离所得组分

3．2．7 半制备高效液相色谱(Pre-HPLC)分离CCC混合样品

3．2．8 ESI-MS条件

3．3 结果与讨论

3．3．1 黄顶菊粗提物的HPLC分析

3．3．2 黄顶菊中黄酮苷的CCC分离

3．3．3 半制备高效液相色谱(Pre-HPLC)分离CCC混合物中两种黄酮苷

3．3．4 黄顶菊中四种黄酮苷的结构鉴定

3．3．5 黄顶菊中黄酮醇的CCC分离

3．4 小结

第四章 黄顶菊中黄酮硫酸酯的分离及结构鉴定

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器

4．2．2 材料和试剂

4．2．3 黄顶菊粗提物的制备及大孔树脂初步纯化粗品

4．2．4 逆流色谱两相溶剂系统、样品溶液的准备及分配系数的测定

4．2．5 高速逆流色谱(HSCCC)分离过程及CCC组分的脱盐

4．2．6 分析型高效液相色谱(HPLC)分析粗提物及逆流分离所得组分

4．3 结果与讨论

4．3．1 不同色谱条件下黄顶菊粗品的HPLC分析及粗品的大孔树脂初步纯化

4．3．2 逆流色谱分离异鼠李素-3-硫酸酯溶剂系统的选择

4．3．3 异鼠李素-3-硫酸(4)的结构鉴定

4．4 小结

第五章 黄顶菊中六种主要物质的含量测定及高效液相色谱指纹图谱的研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验材料、试剂及仪器

5．2．2 HPLC色谱条件的选择

5．2．3 标准溶液的制备及标准曲线的绘制

5．2．4 样品溶液的制备

5．2．5 方法学考察实验

5．2．6 HPLC指纹图谱分析相似度计算

5．3 结果与讨论

5．3．1 HPLC色谱条件的优化

5．3．2 定量分析的方法学考察

5．3．3 黄顶菊样品的测定

5．3．4 黄顶菊叶HPLC指纹图谱的建立及相似度计算

5．4 小结

第六章 紫云英苷国家标准样品的研制

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 实验仪器

6．2．2 材料和试剂

6．2．3 黄顶菊粗提物的制备

6．2．4 逆流色谱两相溶剂系统和逆流色谱样品溶液的准备

6．2．5 高速逆流色谱(HSCCC)连续进样分离制备紫云英苷(As)过程

6．2．6 HPLC纯度检查及含量测定

6．3 结果与讨论

6．3．1 HSCCC连续进样分离黄顶菊中紫云英苷(As)

6．3．2 HPLC纯度检查及含量测定

6．3．3 紫云英苷(As)结构鉴定

6．3．4 均匀性检验

6．3．5 稳定性检验

6．3．6 实验室间定值

6．3．7 标准样品的包装及储运

6．4 小结

第七章 黄顶菊中黄酮类化合物抗氧化性研究

7．1 引言

7．2 实验部分

7．2．1 实验材料、试剂及仪器

7．2．2 清除DPPH自由基实验方法

7．2．3 总抗氧化能力T-AOC,清除超氧阴离子自由基和清除羟自由基实验方法

7．3 结果与讨论

7．3．1 黄顶菊中黄酮类化合物的DPPH自由基清除作用

7．3．2 黄顶菊中黄酮类化合物的总抗氧化能力T-AOC

7．3．3 黄顶菊中黄酮类化合物清除超氧阴离子自由基作用

7．3．4 黄顶菊中黄酮类化合物清除羟自由基作用

7．4 小结

第八章 结论与展望

8．1 主要结论

8．2 创新点

8．3 展望

参考文献

附图

研究成果及发表的学术论文

致谢

作者及导师简介

博士研究生学位论文答辩委员会决议书