重组人源明胶在毕赤酵母中的表达条件的探索

摘要

明胶是失去活性的胶原，具有许多优良的理化性质，被广泛应用于食品、美容、医疗及感光材料等多种行业。目前，明胶的主要来源于动物。这样的明胶存在病毒和阮病毒的潜在危险。重组有很好的提供稳定的、可预测性，同时能知道准确的分子量。但是目前重组的明胶一般未能发生羟化或羟化的程度很低。
　　 本研究中所用到的毕赤酵母重组了明胶片段基因和明胶脯氨酰羟化酶基因，并实现了共表达。在诱导液的上清中，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们检测到脯氨酰羟化酶的β亚基（二硫键异构酶）和重组明胶，并对明胶进行了N端测序，结果与明胶的理论N端氨基酸序列完全吻合。
　　 我们通过对诱导条件的优化，电泳观察诱导液上清中二硫键异构酶的含量，来确定使产物最大化的诱导条件。得出的结论是在250mL摇瓶中，在装液量不超过50mL的情况下，温度为25℃，摇床转速为250rpm时，每天添加2次甲醇，添加量为2％为最佳诱导条件，湿菌密度＜0.5g/mL的情况下，菌密度越大，产物积累的越多。二硫键异构酶在第四天达到一个峰值。明胶的产量在第二天就达到一个峰值。
　　 我们通过羟脯氨酸法测定了诱导上清中的明胶含量，数据显示羟化的明胶占总明胶含量不到20％，在诱导培养基中添加酮戊二酸和维生素C，不仅不能提高羟化明胶的产量，反而抑制了所有诱导产物的表达。

目录

声明

学位论文数据集

摘要

符号说明

第一章 前沿

1．1 明胶概况

1．1．1 胶原蛋白结构

1．1．2 胶原蛋白在生物体内的合成

1．1．3 明胶

1．2 明胶的功能及应用

1．2．1 明胶的功能性质介绍

1．2．2 明胶的应用

1．3 脯氨酰羟化酶

1．3．1 脯氨酰羟化酶

1．3．2 二硫键异构酶

1．4 毕赤酵母表达系统

1．4．1 AOX1启动子

1．4．2 毕赤酵母的优点

1．4．3 毕赤酵母系统存在的不足

1．5 国内外重组明胶的研究现状

1．6 本课题研究的意义

第二章 实验试剂及仪器

2．1 实验试剂

2．2 实验仪器

2．3 培养基及用到的溶液配方

2．3．1 培养基配方

2．3．2 常用试剂(溶液)配方

第三章 二硫键异构酶的诱导表达优化

3．1 菌种培养

3．1．1 平板划线

3．1．2 种子培养

3．1．3 发酵培养

3．1．4 诱导培养

3．1．5 样品电泳

3．2 脯氨酰羟化酶β亚基诱导条件优化

3．2．1 诱导时间的影响

3．2．2 脯氨酸对诱导产物的影响

3．2．3 甲醇添加量对诱导产物的影晌

3．2．4 菌密度对诱导产物的影响

3．2．5 pH对产物的影响

3．3 本章小结

第四章 人源明胶的表达

4．1 单链明胶的鉴定

4．2 羟脯氨酸标准曲线的绘制

4．3 羟化明胶量随时间的变化

4．3．1 羟化明胶随时间变化

4．3．2 二硫键异构酶和重组明胶随时间变化

4．4 添加酮戊二酸和维生素C对产物的影响

4．5 本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

附录一 氨基酸表

附录二

致谢

作者和导师简介

硕士研究生学位论文答辩委员会决议书