利用糖基化转移酶对染料木素糖基化的研究

摘要

大豆异黄酮具有良好的类雌激素作用，同时也是一种天然的癌症预防剂。染料木甙是大豆异黄酮中的一种，与其他种类的大豆异黄酮相比，染料木甙的雌激素活性相对最高，其预防妇女更年期综合症以及抗癌作用的效果也最好。但是市售的大豆异黄酮成分较杂，导致其功能效果不明显。
　　 本研究运用生物转化法，利用糖基化转移酶将染料木素一步转化为染料木甙。从豆芽和蜡状芽孢杆菌ATCC10987的基因组中分别克隆糖基化转移酶GmlF7GT和BcGT-1的基因，选用枯草芽孢杆菌载体pHT43和大肠杆菌载体pETDuet-1和pMAL-c2X，分别构建基因工程菌，在两种表达系统中分别进行了诱导表达的研究。主要工作如下:
　　 1、成功构建枯草芽孢杆菌pHT43-GmlF7GT/WB600和pHT43-BcGT-1/WB600并进行诱导表达，经SDS-PAGE验证，两株基因工程菌均无目的蛋白大小的条带。取粗酶液进行反应，经HPLC和LC-MS分析，反应体系中均无目的产物的产生。分析原因为选用的宿主菌WB600自身分泌的蛋白酶将两种糖基化转移酶GmlF7GT和BcGT-1降解，故构建的基因工程菌表达的外源蛋白不能进行催化。
　　 2、成功构建大肠杆菌 pETDuet-1-BcGT-1/BL21、pMAL-c2X-BcGT-1/BL21 pETDuet-1-GmlF7GT/BL21和pMAL-c2X-GmIF7GT/BL21并进行诱导表达，经过验证，四株基因工程菌诱导表达的外源蛋白均具有催化活性，经与底物染料木素反应能够产生染料木甙，分别测定了酶活与底物转化率。最终实现了染料木甙的生物法转化。

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摘要

第一章 绪论

1．1 大豆异黄酮-染料木甙

1．1．1 染料木甙的基本结构

1．1．2 染料木甙的理化性质

1．1．3 大豆异黄酮的生理功能及应用

1．1．4 大豆异黄酮的生产来源

1．2 UDP-葡萄糖基转移酶(UGTs)

1．2．1 UDP葡萄糖转移酶-UGT1

1．2．2 UDP葡萄糖转移酶-UGT8

1．2．3 UDP葡萄糖基转移酶结构与功能的关系

1．3 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达系统

1．3．1 枯草芽孢杆菌表达系统的优点

1．3．2 枯草芽孢杆菌表达系统的缺点

1．3．3 pHT载体

1．4 大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体

1．4．1 非融合表达载体

1．4．2 融合表达载体

1．4．3 分泌型表达载体

1．5 研究的背景及思路

1．5．1 研究背景

1．5．2 研究目的及意义

第二章 基因工程菌pHT43-GmIF7GT／WB600和pHT43-BcGT-1／WB600的构建

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株和质粒

2．2．2 仪器、试剂、试剂盒和工具酶

2．2．3 PCR引物

2．2．4 培养基

2．3 实验方法

2．3．1 豆芽RNA的提取

2．3．2 豆芽RNA反转录合成cDNA

2．3．3 ATCC 10987菌种基因组的获得

2．3．4 GmIF7GT基因的扩增

2．3．5 BcGT-1基因的扩增

2．3．6 pHT43质粒的提取

2．3．7 目的基因及载体的酶切

2．3．8 目的基因和载体的连接

2．3．9 pHT43-GmIF7GT和pHT43-BcGT-1重组质粒的构建及验证

2．3．10 基因工程菌pHT43-GmIF7GT／WB600和pHT43-BcGT-1／WB600的构建及验证

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 豆芽RNA提取的PCR验证

2．4．2 GmIF7GT基因PCR扩增

2．4．3 BcGT-1基因PCR扩增

2．4．4 pHT43质粒的提取验证

2．4．5 目的基因及载体的酶切后验证

2．4．6 pHT43-GmIF7GT和pHT43-BcGT-1阳性克隆的筛选验证

2．4．7 基因工程菌pHT43-GmIF7GT／WB600和pHT43-BcGT-1／WB600的构建验证

2．5 本章小结

第三章 GmIF7GT和BeGT-1在枯草芽孢杆菌表达系统中的诱导表达

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株和质粒

3．2．2 仪器及试剂

3．3 实验方法

3．3．1 基因工程菌pHT43-GmIF7GT／WB600和pHT43-BcGT-1／WB600的培养与诱导

3．3．2 发酵液上清蛋白浓缩

3．3．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3．3．4 粗酶液进行底物转化

3．3．5 高效液相色谱(HPLC)检测反应产物

3．3．6 液质联用(LC-MS)检测反应产物

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证

3．4．2 高效液相色谱验证

3．4．3 液质联用验证

3．5 本章小结

第四章 基因工程菌pETDuet-1-BcGT-1／BL21、pMAL-c2X-BcGT-1／BL21、pETDuet-1-GmIF7GT／BL21和pMAL-c2X-GmIF7GT／BL21的构建

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 仪器、试剂、试剂盒和工具酶

4．2．3 PCR引物

4．2．4 培养基

4．3 实验方法

4．3．1 BcGT-1基因的扩增

4．3．2 GmIF7GT基因的扩增

4．3．3 pETDuet-1和pMAL—c2X质粒的提取

4．3．4 目的基因及载体的酶切

4．3．5 目的基因及载体的连接

4．3．6 pETDuet-1-BcGT-1、pMAL-c2X-BcGT-1、pETDuet-1-GmIF7GT和pMAL-c2X-GmIF7GT重组质粒的构建及验证

4．3．7 基因工程菌pETDuet-1-BcGT-1／BL21、pMAL-c2X-BcGT-1／BL21、pETDuet-1-GmIF7GT／BL21和pMAL-c2X-GmIF7GT／BL21的构建及验证

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 BcGT-1基因PCR扩增

4．4．2 GmIF7GT基因PCR扩增

4．4．3 pETDuet-1和lpMAL-c2X质粒的提取验证

4．4．4 目的基因及载体的酶切后验证

4．4．5 pETDuet-1-BcGT-1、pMAL-c2X-BcGT-1、pETDuet-1-GmIF7GT和pMAL-c2X-GmIF7GT阳性克隆的筛选

4．4．6 基因工程菌pETDuet-1-BcGT-1／BL21、pMAL-c2X-BcGT-1／BL21、pETDuet-1-GmIFTGT／BL21和pMAL-c2X．GmIF7GT／BL21的构建验证

4．5 本章小结

第五章 GmIF7GT和BcGT-1在大肠杆菌表达系统中的诱导表达

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 菌株和质粒

5．2．2 仪器及试剂

5．3 实验方法

5．3．1 基因工程菌pETDuet-1-BcGT-1／BL21、pMAL-c2X-BcGT-1／BL21、pETDuet-1-GmIF7GT／BL21和pMAL-c2X-GmIF7GT／BL21的培养与诱导

5．3．2 大肠杆菌中蛋白提取

5．3．3 总蛋白浓度的测定

5．3．4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

5．3．5 粗酶液进行底物转化

5．3．6 高效液相色谱(HPLC)检测反应产物

5．3．7 液质联用(LC-MS)检测反应产物

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 生长曲线的测定

5．4．2 总蛋白浓度

5．4．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证

5．4．4 高效液相色谱验证

5．4．5 液质联用验证

5．4．6 酶活力及转化率的计算

5．5 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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