不同拓扑结构的骨组织工程支架的制备及生物相容性研究

摘要

骨缺损是骨科常见的临床问题，组织工程在治疗骨缺损方面具有巨大的潜力。组织工程支架材料是组织工程的关键要素，其生物性能受多个因素影响，而拓扑结构是影响骨组织工程支架材料生物性能的重要因素之一，因此对其研究具有重要意义。本论文制备了一系列具有不同拓扑结构的组织工程支架材料，包括不同表面元素分布和粗糙度的聚膦腈膜、相分离法制备的聚乳酸纳米纤维/碳纳米材料复合支架、电纺丝法制备的生物活性玻璃纳米粒子掺杂的碳纳米纤维膜和具有荧光的纳米纤维膜。通过使用成骨细胞和骨髓间充质干细胞进行的体外实验以及动物体内实验对此类具有不同拓扑结构的组织工程支架的生物性能进行评价，考察了碳纳米材料、生物活性玻璃纳米粒子等活性物质的添加对纳米纤维支架生物性能的影响，并对可降解纳米纤维支架的体内追踪方法做了初步的研究。
　　为评价不同材料的生物性能，本文首先对成骨细胞和骨髓间充质干细胞进行了分离培养，所得的细胞活性良好，纯度较高，有成骨活性，可以用于组织工程支架材料的生物性能检测。
　　通过在不同湿度下制备了较简单的具有不同表面拓扑结构的PGAP和PLGA膜。通过控制环境湿度，在80％的高湿度下制备的PGAP6-80和PGAP12-80具有蜂窝状表面拓扑结构，而在20％的低湿度下制备的PGAP6-20和PLGA6-20则具有相对光滑的平面结构，蛋白吸附的能力与表面粗糙度呈正比。PGAP膜表面具有高比例的P元素和N元素，因此具有较好的亲水性。PGAP膜均具有较好的诱导矿化能力，其中表面粗糙度较大以及P含量较多的PGAP12-80诱导矿化能力最强。通过细胞体外实验证明，PGAP对MC3T3-E1细胞的贴附和增殖促进作用不明显，但是对其成骨分化有显著的促进作用。
　　通过热致相分离法制备了具有较复杂纳米纤维结构的PLLA纳米纤维支架，其结构与天然细胞外基质类似，并在其中成功引入了CNT和NGP，且在纤维中分散均匀。通过BMSC细胞体外实验和植入裸鼠体内的动物实验，证明纳米纤维结构以及碳纳米材料的添加对BMSC细胞的贴附和增殖有促进作用，并在体外和体内均能诱导BMSC向成骨方向分化。碳纳米材料的加入提高了支架材料的成骨诱导性能，提升效果与添加量呈正比，且NGP的效果优于CNT。
　　通过在电纺丝过程中使用不同的接收装置，制备了具有平行和无规两种可控拓扑结构的碳纳米纤维，并通过BMSC体外实验证明具有平行拓扑结构的碳纳米纤维更有利于细胞的成骨分化;以TEP、TEOS和硝酸钙为溶胶原料，以分子量10万的PAN为基体，采用静电纺丝、溶胶-凝胶及后烧结的方法制备了具有平行拓扑结构的负载不同生物活性玻璃纳米颗粒的碳纳米纤维，通过BMSC细胞体外实验和植入裸鼠体内的动物实验，证明中等硅含量的68S生物玻璃掺杂碳纤维最有利于BMSC在体外和体内的成骨分化。
　　通过电纺丝法制备了PLLA/d-p48荧光纳米纤维膜，纤维形态良好，荧光强烈。d-p48分子在PLLA纳米纤维中稳定，没有检测到被动扩散溶出的发生。植入动物体内2周后，纳米纤维膜荧光依然强烈，可以清楚显示材料的形态，且对动物无明显的急性毒性作用。
　　综上所述，骨组织工程支架材料的拓扑结构对其生物性能具有重要的影响，此外，碳纳米材料、生物玻璃纳米粒子等生物活性物质的添加也对骨组织工程支架材料的生物性能有改善的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 骨组织

1．1．1 骨的形态分类

1．1．2 骨的构造

1．1．3 骨的化学成分和物理性质

1．1．4 骨组织的超微结构

1．1．5 骨组织的发生与生长

1．1．6 骨缺损的原因

1．1．7 骨组织的修复

1．1．8 传统的骨缺损治疗方法

1．2 引导组织再生

1．2．1 引导组织再生的简介

1．2．2 材料表面拓扑结构对细胞的影响

1．2．3 引导骨组织再生材料

1．2．4 碳纳米材料

1．3 纳米纤维支架的制备方法

1．3．1 相分离法

1．3．2 电纺丝法

1．4 课题的目的及意义

第二章 成骨细胞和骨髓间充质干细胞的培养

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验原料与试剂

2．2．2 实验仪器与设备

2．2．3 实验方法

2．2．4 常用培养液体

2．2．5 成骨细胞MC3T3-E1的培养及表征

2．2．6 小鼠骨髓问充质干细胞(BMSC)的培养和表征

2．3 结果与讨论

2．3．1 RC3T3-E1细胞的培养

2．3．2 小鼠BMSC的分离和培养

2．4 小结

第三章 具有蜂窝状表面聚膦腈膜的制备及其对成骨细胞的作用

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 实验原料与试剂

3．2．2 实验仪器与设备

3．2．3 实验方法

3．2．4 原料的提纯和PLGA70／30的合成

3．2．5 甘氨酸乙酯-丙氨酸乙酯共取代聚磷脯的合成

3．2．6 PGAP平面膜与蜂窝状表面膜的制备

3．2．7 PGAP、PLGA平面膜与蜂窝状表面膜的表征

3．2．8 PGAP、PLGA平面膜与蜂窝状表面膜的蛋白吸附性能

3．2．9 PGAP、PLGA平面膜与蜂窝状表面膜的体外矿化性能

3．2．10 PGAP、PLGA平面膜与蜂窝状表面膜的生物性能评价

3．3 结果与讨论

3．3．1 膜的表面形态及粗糙度

3．3．2 PGAP和PLGA膜的表面元素及亲水性

3．3．3 PGAP和PLGA膜的蛋白吸附性能

3．3．4 PGAP和PLGA膜的矿化能力

3．3．5 PGAP和PLGA膜的生物性能

3．4 小结

第四章 相分离法制备聚乳酸／碳纳米材料复合纳米纤维支架及其生物性能的评价

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验原料与试剂

4．2．2 实验仪器与设备

4．2．3 实验方法

4．2．4 PLLA纳米纤维支架的制备

4．2．5 PLLA／CNT和PLLA／NGP纳米纤维复合支架的制备

4．2．6 PLLA／CNT和PLLA／NGP纳米纤维复合支架的表征

4．2．7 PLLA／CNT和PLLA／NGP纳米纤维复合支架的生物性能评价

4．3 结果与讨论

4．3．1 PLLA、PLLA／CNT和PLLA／NGP纳米纤维复合支架的形态

4．3．2 PLLA、PLLA／CNT和PLLA／NGP纳米纤维复合支架的亲水性

4．3．3 PLLA、PLLA／CNT和PLLA／NGP纳米纤维复合支架的生物性能

4．4 小结

第五章 电纺丝法制备负载生物玻璃粒子的碳纳米纤维膜及其生物性能的评价

5．1 前言

5．2 实验部分

5．2．1 实验原料与试剂

5．2．2 实验仪器与设备

5．2．3 实验方法

5．2．4 具有不同拓扑结构的碳纳米纤维的制备及生物性能评价

5．2．5 负载不同生物玻璃纳米粒子的碳纳米纤维的制备及生物性能评价

5．3 结果与讨论

5．3．1 平行和无规取向碳纳米纤维的形态

5．3．2 平行和无规取向碳纳米纤维的生物性能

5．3．3 掺杂生物玻璃纳米粒子的碳纳米纤维的表征

5．4 小结

第六章 电纺丝法制备荧光纳米纤维膜及其生物性能的评价

6．1 前言

6．2 实验部分

6．2．1 实验原料与试剂

6．2．2 实验仪器与设备

6．2．3 实验方法

6．2．4 荧光纳米纤维膜的制备

6．2．5 荧光纳米纤维膜的形态观察

6．2．6 荧光纳米纤维膜的体外释放实验

6．2．7 荧光纳米纤维膜的体内植入实验

6．3 结果与讨论

6．3．1 荧光纳米纤维膜的形态

6．3．2 荧光纳米纤维膜的体外释放

6．3．3 荧光纳米纤维膜的体内稳定性及成像效果

6．4 小结

第七章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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