一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材料及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材料及其制备方法。首先将胶原与羟基磷灰石进行不同比例的混合，形成不同浓度梯度的胶原/羟基磷灰石混合乳液，再将制作好的脱细胞化骨浸入不同浓度的混合液中，灌流，轻轻振荡，在支架表面形成均匀的胶原/羟基磷灰石涂层，最后经过冷冻干燥和交联处理得到具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料。该发明可在不改变三维支架微结构的情况下在支架表面形成不同刚度的基质，支架材料具有良好的生物相容性，利于不同干细胞的增殖与分化，而且原料成本较低，易于制作。

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨组织工程支架材料及其制备方法，特别是一种 具有不同刚度的脱细胞化骨-胶原/羟基磷灰石三维支架材料及其制备 方法。

背景技术

为了获得具有良好组织性、功能性的组织，组织工程支架材料应 该尽可能的模拟天然细胞外基质的结构和化学特征。成功的支架材料 应该可以模拟体内自然的力学特征并经得起体内的应力环境。支架材 料的力学特征对影响细胞行为以及控制外部力学信号传递到细胞内 具有重要的作用。细胞可以感知并对它们所接触到的基底做出响应， 不同的基质刚度在二维条件下可以诱导间充质干细胞分别分化成为 不同的细胞类型，包括神经细胞、肌原细胞和成骨样细胞等(Engler AJ, Sen S,Sweeney HL,Discher DE.Matrix elasticity directs stem cell  lineage specification.Cell.2006;126:677-689.)。三维培养可以更好的 模拟细胞在体内的真实微环境，但目前有关基质刚度对干细胞分化的 研究主要集中在二维条件下。有文献报道利用胶原(Hadjipanayi E, Mudera V,Brown RA.Brown.Guiding cell migration in3D:a collagen  matrix with graded directional stiffness.Cell Motil Cytoskeleton.2009; 66:121-128.)、聚乳酸(poly-lactic acid,PLLA)/聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (poly-lactic co glycolic acid,PLGA)(Levy-Mishali M,Zoldan J, Levenberg S.Effect of scaffold stiffness on myoblast differentiation. Tissue Eng Part A.2009;15:935-944.)等来研究具有不同刚度的支架 材料对干细胞分化的影响。在骨组织工程支架材料领域，已有文献报 道利用水凝胶形成合适刚度的准三维支架，可诱导间充质干细胞朝成 骨方向分化(Naito H,Dohi Y,Zimmermann WH,Tojo T,Takasawa S, Eschenhagen T,Taniguchi S.The effect of mesenchymal stem cell  osteoblastic differentiation on the mechanical properties of engineered  bone-like tissue.Tissue Eng Part A.2011;17:2321-2329.)；利用聚醚氨 酯(polyether urethanes)形成的具有不同刚度和几何形状的准三维支架 可以影响MC3T3-E1细胞的组织形成面积(Kommareddy KP,Lange C, Rumpler M,Dunlop JW,Manjubala I,Cui J,Kratz K,Lendlein A,Fratzl  P.Two stages in three-dimensional in vitro growth of tissue generated by  osteoblastlike cells.Biointerphases.2010;5:45-52.)。Huebsch等 (Huebsch N,Arany PR,Mao AS,Shvartsman D,Ali OA,Bencherif SA, Rivera-Feliciano J,Mooney DJ.Harnessing traction-mediated  manipulation of cell/matrix interface to control stem-cell fate.Nat Mater. 2010;9:518-26.)的研究表明，不同三维环境刚度可以改变间充质干细 胞的谱系分化，而间充质干细胞在11～30kPa的三维刚度下可以分化 为成骨细胞，尤其是在22kPa时往成骨方向分化效果最好。然而，目 前还未见三维骨组织工程支架材料可在保持微结构和孔隙率基本不 变的同时形成不同刚度基质。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在三维条件下构建具有不同刚度的 骨组织工程支架材料，目的是在不改变三维支架微结构的情况下在支 架表面形成不同刚度的基质。

为解决上述技术问题，本发明的具有不同刚度三维骨组织工程支 架材料由脱细胞化骨和胶原/羟基磷灰石构成；其特征在于，利用脱 细胞化骨保持支架材料的三维微结构，利用不同配比胶原/羟基磷灰 石包被处理脱细胞化骨，形成具有不同基质刚度的三维骨组织工程支 架材料，以利于诱导干细胞的特定谱系分化。

本发明中，脱细胞化骨可采用常规的方法制备，简而言之为，取 新鲜猪股骨头的松质骨，用4℃的0.9%盐水浸泡送至清洁条件下，清 除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成直径为2～20 mm、高为2～20mm的圆柱体或者长×宽×高为2～20mm×2～20mm ×2～20mm的立方体等形状样品，冲洗，然后浸泡在蒸馏水中4℃过 夜。用1%的Triton X-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。 DNA酶/RNA酶37℃温育样品2h后，用PBS清洗并持续晃动。将支架 浸入无水乙醇中4h，以除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子 水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞化骨，保存在4℃环境下。

脱细胞化骨具有三维微孔结构，孔直径可控制在300～800μm，孔 隙率可以达到80%～95%，并具有良好的联通性。将不同浓度配比的 胶原和羟基磷灰石混合物通过灌流的方式对上述脱细胞化骨内部进 行处理，得到具有不同梯度刚度的三维骨组织工程支架材料。

本发明还提供所述的具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料 的制备方法，具体步骤如下：

1)制备脱细胞骨三维支架；

2)配制不同浓度比例的胶原/羟基磷灰石溶液，将步骤1)得到的 支架材料浸入所配制溶液中进行灌流，轻轻振荡，保证溶液在材料表 面形成均匀的涂层；

3)冷冻、干燥步骤2)得到的经不同配比胶原/羟基磷灰石包被处 理的脱细胞骨三维支架；

4)将步骤3)得到的经不同配比胶原/羟基磷灰石包被处理的脱细 胞骨三维支架通过1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基-碳化二亚氨 (N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC) 和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)进行交联后，通过 0.1mol/L Na₂HPO₄·12H₂O将其浸泡清洗1h，然后用去离子水对其清 洗，之后将其冷冻干燥得到具有不同刚度三维骨组织工程支架材料；

5)将步骤4)得到的具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料通 过⁶⁰Co(2M rad)放射消毒后，将其无菌密封后干燥保存。

优选地，步骤1)所述的脱细胞骨三维支架制备方法，是取新鲜猪 股骨头的松质骨，用4℃的0.9%盐水浸泡送至清洁条件下，清除样品 上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成所需形状样品，冲洗， 然后浸泡在蒸馏水中4℃过夜。用1%的Triton X-100处理样品48h。 用甲醇对样品进行脱脂24h。DNA酶/RNA酶37℃温育样品2h后，用 PBS清洗并持续晃动。将支架浸入无水乙醇中4h，以除去支架上的细 胞残余物。用大量的去离子水清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞 化骨，保存在4℃环境下。

优选地，步骤1)所述的脱细胞骨三维支架制备成直径为2～20 mm、高为2～20mm的圆柱体或者长×宽×高为2～20mm×2～20mm ×2～20mm的立方体等形状样品。

优选地，步骤2)所述的胶原/羟基磷灰石溶液中羟基磷灰石的质量 分数为5wt%～70wt%，胶原质量分数根据所需要刚度在0.1wt%～2.0 wt%间变化。

优选地，步骤2)所述的胶原/羟基磷灰石溶液混合方法为：将上述 计算好质量分数的羟基磷灰石粉末缓慢加入已经完全溶解的计算好 质量分数的胶原溶液中，不断搅拌，使胶原与羟基磷灰石粉末混合均 匀。

综上所述，本发明的具有不同刚度三维骨组织工程支架材料通过 脱细胞骨支架保证材料的三维结构不变，利用不同配比的胶原/羟基 磷灰石在支架表面形成不同刚度三维支架材料。与现有的三维骨组织 工程支架材料相比，本发明的三维骨组织工程支架材料克服了大多数 骨组织工程支架材料在改变基质刚度的同时也改变了微结构的缺陷， 这也是本发明提出的关键。本发明提供的三维骨组织工程支架材料具 有良好的生物相容性，可保证骨支架的天然微结构和成分，并具有良 好的联通性，有利于细胞的粘附与生长，利于营养物质的进入以及细 胞代谢废物的及时排出。利用胶原/羟基磷灰石形成的不同刚度，利 于不同干细胞的增殖与分化，可以促进新的骨的生成。用于制备三维 骨组织工程支架材料的脱细胞骨可选择不同动物不同部分的骨作为 材料，只要满足所要修复骨的要求即可。为简洁期间，本发明主要以 猪股骨头的松质骨为例加以阐述，其他动物和部分骨也可以采用相同 的原理。

附图说明

图1示出了分别由本发明提供的一种具有不同刚度三维骨组织 工程支架材料制备方法中使用的不同浓度配比的胶原和羟基磷灰石 所制备的支架的压缩杨氏模量。

图2是本发明提供的一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材 料制备方法中脱细胞化骨支架被0.7wt%胶原/22wt%羟基磷灰石混 合溶液表衬前后的孔径分布图。

图3是本发明提供的一种具有不同刚度三维骨组织工程支架材 料制备方法中脱细胞化骨支架被0.7wt%胶原/22wt%羟基磷灰石混 合溶液表衬前后的壁厚分布图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

将取自新鲜猪股骨头的松质骨用4℃的0.9%盐水浸泡送至清洁 条件，清除样品上的残余肌肉和组织，根据临床骨缺损情况制成直径 为2～20mm、高为2～20mm的圆柱体或者2～20mm×2～20mm×2～20 mm的立方体等形状样品，冲洗，然后浸泡在蒸馏水中4℃过夜。用 1%Triton X-100处理样品48h。用甲醇对样品进行脱脂24h。DNA酶 /RNA酶37℃温育样品2h后，用PBS对其清洗并持续晃动。将支架浸 入无水乙醇中4h，来除去支架上的细胞残余物。用大量的去离子水 清洗支架2h，干燥支架，获得脱细胞化骨，保存在4℃环境下。脱 细胞化骨孔直径可控制在300～800μm，孔隙率可控制在80%～95%。

将计算好质量分数的羟基磷灰石粉末缓慢加入已经完全溶解的 计算好质量分数的胶原溶液中，不断搅拌，使胶原与羟基磷灰石粉末 混合均匀。胶原/羟基磷灰石溶液中羟基磷灰石的质量分数为5 wt%～70wt%，胶原质量分数根据所需要刚度在0.1wt%～2.0wt%间变 化。例如胶原含量为0.5wt%，羟基磷灰石为22wt%的一组，先称取 胶原50mg，用10mL0.01mol/L的HCl溶解完全溶解，然后称取羟基 磷灰石粉末2.2g，缓缓加入已经溶解的胶原溶液中，4℃下持续搅 拌过夜使胶原溶液与羟基磷灰石混合均匀。

将不同浓度配比的胶原和羟基磷灰石混合物通过灌流的方式对 上述三维脱细胞化骨内部进行处理，使胶原和羟基磷灰石混合物在支 架表面均匀覆盖。将包被处理好的支架材料首先在-20℃条件下冷冻 24h，然后在-55℃、15Pa条件下进行冷冻干燥24h。然后将冷冻干 燥好的胶原/羟基磷灰石三维支架材料用溶解于无水乙醇的EDC和 NHS进行交联24h，再用0.1mol/L的Na₂HPO₄·12H₂O溶液浸泡清洗支 架1h，最后用去离子水清洗多次后，在-55℃、15Pa条件下进行冷 冻干燥24h，得到具有不同刚度的三维骨组织工程支架材料，然后通 过⁶⁰Co(2M rad)放射消毒，之后将其无菌密封后干燥保存，备用。

为验证所使用方法的可行性，制备了胶原含量为分别为0.35 wt%、0.5wt%和0.7wt%，羟基磷灰石为22wt%等的多组胶原/羟基磷 灰石支架。下面将以胶原含量为分别为0.35wt%、0.5wt%和0.7wt%， 羟基磷灰石为22wt%的三组胶原/羟基磷灰石支架为例进行说明，如 图1所示，利用美国Bose公司ELF3330力学测试仪器得到它们的平均 压缩杨氏模量为6.74±1.16kPa、8.82±2.12kPa和23.61±8.06kPa。实验 测得脱细胞化骨支架在利用0.7wt%胶原/22wt%羟基磷灰石混合溶 液表衬前后孔径、孔隙率、孔径分布和壁厚分布均没有显著性差异。 图2和图3分别为脱细胞化骨支架在0.7wt%胶原/22wt%羟基磷灰石 混合溶液表衬前后的孔径和壁厚分布图。

本发明提供的三维骨组织工程支架材料通过脱细胞骨实现天然 骨微结构和成分，利用不同配比胶原/羟基磷灰石包被处理脱细胞骨， 在不改变支架微结构的情况下形成不同刚度的三维多孔支架材料。正 是由于这些综合因素，使得本发明提供的三维骨组织工程支架材料良 好的生物相容性，利于不同干细胞的增殖与分化，可以促进新的骨的 生成。制备方法简单且成本低，相比以往的三维骨组织工程支架材料 有明显的优势。