葡萄糖脱氢酶基因表达及吡咯喹啉醌生物合成

摘要

葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，GDH)包括NADP+依赖的葡萄糖脱氢酶和醌蛋白葡萄糖脱氢酶。作为磷酸戊糖途径的关键酶，NADP+依赖的葡萄糖脱氢酶在食品医药领域发挥重要作用。醌蛋白葡萄糖脱氢酶以吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)为辅酶，作为新型辅因子在医药等方面而引起关注。葡萄糖脱氢酶的生物学功能研究虽有一段历史，但需完善，同时吡咯喹啉喹的产量还处于很低水平，本课题针对目前存在的问题做了深入研究，旨在研究葡萄糖脱氢酶的生物学功能及提高吡咯喹啉醌的发酵产量:
　　1、对来源于肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌中的NADP+依赖的葡萄糖脱氢酶的基因序列进行比对并构建工程菌，通过测定三株工程菌生物量、葡萄糖剩余量以及酶活，发现相比带有空质粒的菌株，三株工程菌的生物量显著提高，葡萄糖剩余量明显减少，酶活性分别提高为8.5倍、10.5倍和12倍，表明葡萄糖脱氢酶的超表达可以促进菌体生长。
　　2、PCR扩增来源于大肠杆菌中的醌蛋白葡萄糖脱氢酶基因，构建重组载体后导入到肺炎克雷伯氏菌中。随后通过高效液相色谱法探索PQQ检测条件，确定波长为200 nm，流速为0.8 mL/min，并确定流动相中甲醇与水（加入5‰磷酸）的泵比例为10∶90，绘制PQQ标准曲线，R2为0.999，并对构建的工程菌中PQQ含量进行检测。
　　3、以PQQ的合成前体物谷氨酸和酪氨酸为切入点，分别进行单因素水平和四因素三水平正交实验做发酵条件优化。单因素实验中分别添加谷氨酸和酪氨酸以及它们的混合物，PQQ的产量分别达到约为1044.91mg/L，626.7 mg/L和1186.21 mg/L。正交实验中通过对发酵温度，转速，发酵培养基中碳源和氮源的浓度优化，使发酵液中PQQ的最终产量达1226.37mg/L，该研究为PQQ的高产奠定基础。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 葡萄糖脱氢酶的发现和分布

1．1．1 葡萄糖脱氢酶的发现

1．1．2 葡萄糖脱氢酶的分布

1．2 葡萄糖脱氢酶的分类

1．2．1 MDP+依赖的葡萄糖脱氢酶

1．2．2 PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶

1．3 葡萄糖脱氢酶的生物学功能

1．3．1 生物领域

1．3．2 食品和医药领域

1．4 吡咯喹啉醌的发现和分布

1．4．1 吡咯喹啉醌的发现

1．4．2 吡咯喹啉醌的分布

1．5 吡咯喹啉醌的生物合成基因

1．5．1 吡咯睦啉醌产生菌的基因组成及同源性分析

1．5．2 pqqA

1．5．3 pqqB

1．5．4 pqqC

1．5．5 pqqD和pqqE

1．5．6 pqqF

1．6 生物学功能

1．6．1 生物防治剂和植物生长促进因子

1．6．2 临床应用

1．6．3 信号转导中的应用

1．6．4 生物电子学领域的发展

1．7 PQQ的检测

1．7．1 酶法

1．7．2 高效液相色谱法

1．7．3 非酶法

1．8 本课题的研究意义

第二章 不同来源葡萄糖脱氢酶基因克隆表达

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种和质粒

2．2．2 培养基

2．2．3 主要试剂

2．3 构建重组大肠杆菌

2．3．1 基因组的提取

2．3．2 扩增葡萄糖脱氢酶基因gdh

2．3．3 构建pET28a-gdh载体

2．3．4 鉴定pET28a-gdh载体

2．3．5 构建工程菌

2．3．6 三株工程菌中gdh基因序列同源性比对

2．4 工程菌中gdh基因的表达

2．5 工程菌的发酵

2．5．1 测定工程菌生物量

2．5．2 绘制葡萄糖含量的标准曲线

2．5．3 测定工程菌的葡萄糖含量

2．5．4 绘制NADH标准曲线

2．5．5 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶的活性

2．6 结果与讨论

2．6．1 提质粒

2．6．2 提取基因组

2．6．3 扩增gdh基因片段

2．6．4 鉴定pET28a-gdh载体

2．6．5 构建BL21(pET28a-gdh)工程菌

2．6．6 工程菌中gdh基因的序列分析

2．6．7 工程菌中gdh基因的表达

2．6．8 测定工程菌的生物量

2．6．9 葡萄糖含量的标准曲线

2．6．10 测定工程菌中葡萄糖含量

2．6．11 NADH标准曲线

2．6．12 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶活性

2．7 本章小结

第三章 大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆与表达及PQQ检测

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌种和质粒

3．2．2 培养基

3．2．3 主要试剂

3．3 构建工程菌

3．3．1 扩增葡萄糖脱氢酶基因gdh

3．3．2 构建pETpk-gdh载体

3．3．3 鉴定pETpk-gdh载体

3．3．4 构建工程菌

3．3．5 K．p(pETpk-gdh)中gdh基因序列同源性比对分析

3．4 工程菌gdh基因的表达

3．5 确定高效液相色谱检测PQQ的条件

3．5．1 排除高效液相色谱中各试剂组分的干扰

3．5．2 确定PQQ分析的最佳波长

3．5．3 确定PQQ分析的最佳流速

3．5．4 确定最佳配比

3．5．5 绘制PQQ标准曲线

3．6 工程菌的发酵

3．6．1 测定K．p(pETpk-gdh)工程菌的生物量

3．6．2 测定K．p(pETpk-gdh)工程菌中的葡萄糖含量

3．6．3 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶活性

3．6．4 工程菌的PQQ含量的测定

3．7 结果与讨论

3．7．1 提取K．pneLrnoniae(pETpk)质粒

3．7．2 扩增gdh基因片段

3．7．3 鉴定pETpk-gdh载体

3．7．4 构建K．p(pETpk-gdh)工程菌

3．7．5 工程菌中gdh基因的序列分析

3．7．6 工程菌gdh基因的表达

3．7．7 排除高效液相色谱中各试剂组分的干扰

3．7．8 确定PQQ分析的最佳波长

3．7．9 确定PQQ分析的最佳流速

3．7．10 确定最佳配比

3．7．11 绘制PQQ标准曲线

3．7．12 测定工程菌的生物量

3．7．13 测定工程菌中葡萄糖含量

3．7．14 测定工程菌的GDH蛋白质含量和酶活性

3．7．15 工程菌的P00含量的测定

3．8 本章小结

第四章 添加前体物对PQQ产量的影响

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 菌种

4．2．2 培养基

4．2．3 主要试剂

4．3 单因素实验

4．3．1 谷氨酸对PQQ产量的影响

4．3．2 酪氨酸对PQQ产量的影响

4．3．3 谷氨酸和酪氨酸混合物对PQQ产量的影响

4．4 正交实验

4．5 结果分析

4．5．1 谷氨酸对PQQ产量的影响

4．5．2 酪氨酸对PQQ产量的影响

4．5．3 谷氨酸和酪氨酸对PQQ产量的影响

4．5．4 正交实验

4．6 本章小结

第五章 结论

5．1 本课题主要结论

5．2 创新点

5．3 问题与建议

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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