基于2-羟丙基甲基丙烯酰胺共聚物的结构调控及生物功能研究

摘要

癌症作为人类健康的主要威胁之一，每年都将夺走数百万人的生命。常规的化学治疗通过药物对癌细胞进行杀伤，但是化疗药物选择性较差，在杀灭肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生毒副作用。因此，抗肿瘤药物的靶向传递及控制释放成为了人们关注的焦点。
　　高分子材料具有可控的结构与组成，以及良好的物理、化学和生物性能，在药物控制释放领域得到广泛的研究。相比于常规的小分子抗肿瘤药物，以高分子材料为基础的纳米药物可以提高药物的靶向能力、控制药物释放速度、延长药物的血液循环时间并降低药物的毒副作用。其中聚((N-2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(PHPMA)作为一种无毒无免疫原性的水溶性聚合物载体受到了广泛关注。本论文以构建新型的高效肿瘤靶向纳米药物载体为目的，通过对HPMA及其甲基丙烯酰胺类衍生物的共聚物的合成及生物功能研究，探索了载体的不同纳米特性对药物运输能力的影响，并最终获得了一种抑瘤效果显著、具有一定应用前景的纳米药物。
　　实验首先合成了具有还原响应性的单体N-叔丁基羰基胱胺甲基丙烯酰胺(MABC)，然后以PEG5k-CTA为大分子链转移剂，通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT聚合)，得到结构明确并且分子组成可控的嵌段共聚物PEG-b-PMABC，又在此聚合物基础上合成了三嵌段共聚物PEG-b-PMABC-b-PS。将聚合物自组装为胶束后，通过加入三氟乙酸(TFA)对Boc基团进行脱除，从而对胶束的表面电荷和粒径进行调整。研究发现，由于加入TFA后氢键被破坏，双嵌段聚合物胶束的粒径瞬间增大，而三嵌段胶束具有紧密的疏水层结构可以使胶束在加入TFA后维持粒径不变。胶束电荷的变化由Boc基团的脱除及氨基基团的暴露引起，其脱除过程按照从胶束外层到内层的顺序进行。以此理论为基础，最终获得了一系列组成不变，电荷与粒径可以连续且独立进行调节的载药胶束，粒径的调节范围为直径50 nm-210 nm，电荷的调节范围为-16 mV-+60 mV。这一方法为更精确的研究载体纳米特性对其生物功能的影响提供了技术准备。
　　在此基础上，本文进一步研究了具有不同表面电荷及粒径的胶束的细胞内吞速度，结果表明正电荷有利于胶束的细胞内吞，同时具有还原响应性的药物载体在细胞内部会逐渐解体，并引起其负载的药物的快速释放。动物实验结果表明，随着电荷的增大，胶束在肿瘤及各主要脏器中的富集量均随之增加，但是胶束的血液循环时间也随之下降。胶束的肿瘤渗透能力研究结果表明，较小的粒径及负电荷更有利于胶束在肿瘤组织中的渗透，较大的粒径和正电荷会让胶束倾向于富集在血管周围。以上结果表明纳米药物的抗肿瘤能力受到多方面因素综合作用影响，对于不同的纳米药物体系以及不同的治疗目的，其最优的纳米特性均不同，这一结果有助于我们开发具备更好肿瘤富集能力和治疗效果的新型纳米药物传送体系。
　　由于小粒径胶束肿瘤渗透能力突出但滞留能力弱，而大粒径胶束滞留能力强但肿瘤富集能力较差，因此本文拟利用胶束的自发聚集原理解决这一两难的问题。首先通过RAFT聚合方法，合成一系列基于HPMA及其甲基丙烯酰胺类衍生物的水溶性聚合物，实现对聚合物组成、分子量以及拓扑结构的精确调控。进一步通过聚合物后修饰方法，合成了具有pH响应性的聚合物-阿霉素键合药物。通过DLS和TEM的表征可以发现，键合药物在水中会自组装形成胶束并发生胶束聚集，而聚合物的结构及组成均会一定程度的影响胶束的大小及其聚集行为。通过对聚合物结构及组成的控制，最终获得了一种血液循环时间较长、肿瘤靶向能力十分突出的键合药物体系。小鼠体内抑瘤实验结果表明该键合药物具有良好的抑瘤效果，与对照组相比键合药物给药组肿瘤抑制率最高达到87.1％。通过小鼠的给药观察及体重变化曲线可以发现，游离DOX对小鼠的毒副作用十分明显，而键合药物组则几乎不会对小鼠造成毒副作用。这些结果表明键合药物具有良好的抗肿瘤作用，同时在实验研究剂量范围内具备良好的生物安全性，具有进一步开发及临床应用的广阔前景。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 癌症及其治疗

1．1．1 癌症简介

1．1．2 癌症的治疗

1．2 药物控制释放系统

1．2．1 药物的时间控制释放

1．2．2 药物的分布控制释放

1．3 抗肿瘤纳米药物体系

1．3．1 抗肿瘤药物的靶向传递

1．3．2 抗肿瘤纳米载药体系分类

1．3．3 抗肿瘤纳米载药体系药物传递效率的影响因素

1．3．4 目前商业化或者已进入临床研究的纳米药物剂型概述

1．4 基于PHPMA的纳米载药体系

1．4．1 PHPMA简介

1．4．2 提高纳米药物抗肿瘤能力的途径

1．5 本论文的研究内容及意义

第二章 还原响应性共聚物胶束纳米特性调控及其生物功能研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 主要原料和试剂

2．2．2 测试与表征

2．2．3 单体的合成

2．2．4 聚合物的合成

2．2．5 胶束的制备

2．2．6 聚合物胶束粒径及电荷大小的调节

2．2．7 聚合物胶束的表征

2．2．8 细胞培养

2．2．9 细胞摄取实验

2．2．11 活体荧光成像评价纳米药物载体的生物分布

2．2．12 纳米药物载体的血液清除速率检测

2．2．13 纳米药物载体在肿瘤组织中的渗透能力分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 单体的合成与表征

2．3．2 链转移剂的合成与表征

2．3．3 聚合物的合成与表征

2．3．4 胶束的制备及表征

2．3．5 PEG-b-PMABC胶束粒径及电荷的调节

2．3．6 PEG-b-PMABC-b-PS胶束粒径及电荷的调节

2．3．7 TFA对含PMABC胶束粒径及电荷调控原理探究

2．3．8 细胞内药物释放行为及细胞毒性

2．3．9 胶束载体生物性能的活体评价

2．4 小结

第三章 具有自发聚集特性的靶向抗肿瘤药物载体研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 主要原料和试剂

3．2．2 测试与表征

3．2．3 单体的合成

3．2．4 聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(OEGMA)的合成

3．2．5 聚合物的合成

3．2．6 抗肿瘤药物与聚合物载体的键合

3．2．7 聚合物载药量的测定

3．2．8 聚合物中荧光分子的引入

3．2．9 聚合物键合药物的表征

3．2．10 药物释放速率研究

3．2．11 细胞培养

3．2．12 细胞摄取实验

3．2．13 细胞毒性实验

3．2．14 活体荧光成像评价聚合物药物载体的生物分布

3．2．15 活体光声成像评价聚合物药物载体的生物分布

3．2．16 动物体内抑瘤实验

3．2．17 组织学分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 单体的合成与表征

3．3．2 OEGMA的合成与表征

3．3．3 链转移剂的合成与表征

3．3．4 聚合物的合成与表征

3．3．5 聚合物键合药物的表征

3．3．6 阿霉素的pH响应性释放

3．3．7 键合药物细胞内吞速度研究

3．3．8 键合药物的细胞毒性

3．3．9 聚合物键合药物胶束的活体荧光成像评价

3．3．10 聚合物键合药物胶束的活体光声成像评价

3．3．11 小鼠体内抑瘤实验

3．3．12 小鼠各器官及肿瘤的组织学分析

3．4 本章小结

第四章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者和导师简介