微生物酶法拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物的手性中间体

摘要

乙烯基取代环丙烷氨基酸衍生物被广泛应用于药物的合成领域。其中(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸酯类衍生物是用于合成丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物的重要手性中间体，目前对其的手性合成主要还是利用化学方法，微生物酶的高效拆分方法的研究还较为匮乏。
　　本课题中，我们以1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯盐酸盐为唯一碳源，首次从不同来源的100份土样中，筛选获得能够利用该底物的菌株378株，其中能够选择性水解(1S,2R)-N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯类衍生物的共有54株，选择性水解(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯类衍生物的共有15株。经过传代和鉴定，最终获得拆分效果最优的菌株CY-2，鉴定为Sphingomonas aquatilisJSS7。
　　对CY-2的底物拆分条件进行了优化，底物浓度1 g·L-1，37℃，反应72 h，pH9缓冲液体系，湿菌体量为350 mg。最优条件下，菌株对(1S,2R)构型选择性水解e.e值为88.23％，转化率为62.44％。
　　对CY-2进行了拆分底物谱的研究，制备了乙烯基环丙烷甲酸酯类衍生物以及不同的含酯键和氨基的化合物。在所选不同的11种化合物中，CY-2能够选择性水解其中的7种，其中制备获得(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷甲酸乙酯的e.e值达到99.60％。
　　对另一对底物具有拆分活性的菌株SQR-21进行了基因的挖掘，通过与活性酶Alcalase2.4L比对，利用大肠杆菌重组菌，克隆表达了其中的4段水解酶蛋白进行底物活性拆分实验。结果虽未达到理想值，但仍提供了新的方向。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 手性药物及手性拆分

1．1．1 手性药物研究进展

1．1．2 手性药物的制备方法

1．1．3 全细胞手性拆分

1．1．4 酶的手性拆分

1．2 丙肝NS3酶抑制剂类药物手性中间体

1．2．1 肝炎分类及特点

1．2．2 病毒性肝炎及特点

1．2．3 丙肝病毒的特点及治疗方法

1．2．4 丙型肝炎蛋白酶及其抑制剂

1．2．5 NS3-4A抑制剂的研发进展

1．2．6 乙烯基环丙烷氨基酸及其制备方法

1．3 含脂肪酶(酯酶)微生物菌种的筛选及鉴定

1．3．1 含脂肪酶(酯酶)微生物菌种的筛选

1．3．2 含脂肪酶(酯酶)微生物菌种的鉴定

1．4 课题的研究目的和意义

第二章 丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物中间体的合成及检测条件的确定

2．1 引言

2．2 实验仪器及材料

2．3 实验方法

2．3．1 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体A的合成

2．3．2 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体C的合成

2．3．3 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体D的合成

2．3．4 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中问体及其衍生物对映异构体检测条件的确定

2．4 实验结果与结论

2．4．1 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体A的合成

2．4．2 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体C的合成

2．4．3 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体D的合成

2．4．4 丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体及衍生物检测条件的确定

2．5 本章小结

第三章 选择性拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂药物中间体的微生物及酶的筛选

3．1 引言

3．2 实验仪器及材料

3．2．1 培养基

3．3 实验方法

3．3．1 已有资源的初步筛选

3．3．2 土壤中选择性拆分丙型肝炎NS3酶抑制剂类药物中间体菌株的筛选

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 已有资源的初步筛选

3．4．2 土壤样品中菌株筛选结果

3．4．3 菌株拆分实验结果的检测

3．5 本章小结

第四章 菌株鉴定

4．1 引言

4．2 实验仪器及材料

4．2．1 培养基

4．2．2 溶液及缓冲液的配制

4．3 实验方法

4．3．1 菌株16S rRNA序列的克隆

4．3．2 重组质粒的构建

4．3．3 测序

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 菌株16S rRNA序列的克隆

4．4．2 重组质粒的构建

4．4．3 测序

4．5 本章小结

第五章 高效菌株全细胞拆分底物反应条件的优化

5．1 引言

5．2 实验仪器及材料

5．2．1 培养基

5．2．2 溶液及缓冲液的配制

5．3 实验方法

5．3．1 反应时间对拆分底物的影响

5．3．2 温度对拆分底物的影响

5．3．3 pH对拆分底物的影响

5．3．4 湿菌体重量对拆分底物的影响

5．3．5 金属离子对拆分底物的影响

5．3．6 两相反应对拆分底物的影响

5．3．7 在最适条件下的底物拆分结果

5．3．8 CY-2菌株拆分底物谱的研究

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 反应时间对拆分底物的影响

5．4．2 温度对拆分底物的影响

5．4．3 pH对拆分底物的影响

5．4．4 湿菌体重量对拆分底物的影响

5．4．5 金属离子对拆分底物的影响

5．4．6 两相反应对拆分底物的影响

5．4．7 在最适条件下的底物拆分结果

5．4．8 CY-2菌株拆分底物谱的研究

5．5 本章小结

第六章 基因挖掘法构建基因工程菌及其蛋白的表达

6．1 引言

6．2 实验仪器及材料

6．2．1 培养基

6．2．2 溶液及缓冲液的配制

6．3 实验方法

6．3．1 SQR-21菌的复苏和基因组的提取

6．3．2 SQR-21中水解酶质粒的构建

6．3．2 SQR-21水解酶的诱导表达

6．3．3 SDS-PAGE凝胶电泳

6．3．4 粗酶的拆分活性检测

6．4 实验结果与讨论

6．4．1 SQR-21菌的复苏和基因组的提取

6．4．2 SQR-21片段基因的克隆

6．4．3 SQR-21中水解酶重组质粒的构建

6．4．4 SQR-21水解酶的诱导表达

6．4．5 粗酶的拆分活性检测

6．5 本章小结

第七章 总结与展望

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

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