Sulfolobus solfataricus P2中的（+）γ-内酰胺酶的半理性定向进化

摘要

来源于Sulfolobus solfataricus P2(+)γ-内酰胺酶(Sslact)是一种理想的生物催化剂，催化（±）γ-内酰胺的水解反应并产生(-)γ-内酰胺，一种能够用来合成抗艾滋病药物abacavir的药物中间体。
　　采用同源建模和分子动力学模拟的方法构建Sslact的蛋白质分子模型，并通过结构分析，推测出了催化三联体、疏水口袋和对活性中心的框架起重要作用的氨基酸(3RFA)。催化三联体中的Ser195的羟基氢原子到底物的羰基氧原子之间的距离d1和Cys145羰基氧原子到底物的氨基氢原子之间的距离d2被认为是用来推测是否可获得高酶活突变体的两个重要参数。我们通过计算机模拟预测了几个位于疏水结合口袋和3RFA的氨基酸替换，并利用距离评价假说推测出疏水口袋和3RFA的不可变性，最终选择了远离活性中心的Va1203、Pro377和Tyr388作为了突变热点，以期获得酶活提高的突变体。
　　通过易错PCR(epPCR)、定点突变(sdm)和定点饱和突变(ssm)这些定向进化方法获得了一系列突变体，其中包含了几个酶活提高的阳性突变体V203N、V203Q、Y388H，它们的比酶活分别是418.20 U/mg、373.35 U/mg和1132.87 U/mg，高于野生型菌株(Wild Type/WT)的202.97U/mg。对其结构和酶活的关系进行分析可以发现这些突变体均能够分别从不同层面证实了计算机辅助设计的可靠性。
　　为获得酶活更高的突变体，把两个突变位点结合起来构建了双突变体V203N/Y388H，它的比酶活是1188.69 U/mg，催化效率是WT的2.85倍，米氏常数为2.20×10-2 mM,在50℃到90℃之间能够维持比较高的热稳定性，且金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+能够提高该酶的酶促反应。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 γ-内酰胺酶

1．1．1 γ-内酰胺酶的来源

1．1．2 γ-内酰胺酶的研究现状

1．2 定向进化方法

1．2．1 定向进化的定义和演化

1．2．2 定向进化方法的应用

1．3 计算机辅助蛋白质建模

1．3．1 蛋白质建模的程序

1．3．2 计算机辅助蛋白质建模在突变预测上的应用

1．4 课题研究的内容、意义和目的

1．4．1 课题研究的内容

1．4．2 课题研究的意义和目的

第二章 计算机辅助(+)γ-内酰胺酶分子设计

2．1 引言

2．2 实验仪器及软件

2．3 实验方法

2．3．1 Discovery Studio2．5分子模拟构建(+)γ-内酰胺酶蛋白模型

2．3．2 计算机辅助突变设计

2．4 实验结果与讨论

2．4．1 Sslact-WT蛋白质模型的构建

2．4．2 蛋白质结构分析及距离评价假说的提出

2．4．3 计算机辅助突变设计

2．5 本章小结

第三章 易错PCR构建突变文库

3．1 引言

3．2 实验仪器及材料

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验材料

3．3 实验方法

3．3．1 菌液浓度的测定

3．3．2 高通量筛选方法

3．3．3 易错PCR体系的建立

3．3．4 易错PCR建立突变文库的方法步骤

3．3．5 突变体的克隆表达

3．3．6 构建突变体蛋白模型

3．4 实验结果与讨论

3．4．1 绘制菌体浓度标准曲线

3．4．2 易错PCR突变文库的筛选

3．4．3 突变体的克隆表达

3．4．4 结构解析从易错PCR突变文库获得的突变体

3．5 本章小结

第四章 Sslact酶的定点突变和定点饱和突变

4．1 引言

4．2 实验仪器及材料

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验材料

4．2．3 溶液及缓冲液

4．3 实验方法

4．3．1 定点突变

4．3．2 定点饱和突变

4．3．3 双突变体的构建

4．3．4 Sslact酶的蛋白纯化

4．3．5 蛋白浓度检测

4．3．6 内标法测定Sslact的酶活

4．3．7 构建突变体的蛋白质模型并计算相应能量

4．4 实验结果与讨论

4．4．1 定点突变结果与讨论

4．4．2 定点饱和突变结果与讨论

4．4．3 双突变体的构建

4．4．4 Sslact酶的蛋白纯化

4．4．5 蛋白浓度检测

4．4．6 内标法测定Sslact的酶活

4．4．7 突变体的结构及能量解析

4．5 本章小结

第五章 突变体V203N／Y388H的酶学性质研究

5．1 引言

5．2 实验仪器及试剂

5．2．1 实验仪器

5．2．2 实验试剂

5．2．3 溶液及缓冲液

5．3 实验方法

5．3．1 最适温度

5．3．2 热稳定性

5．3．3 最适pH

5．3．4 金属离子耐受性

5．3．5 酶的催化效率

5．4 实验结果与讨论

5．4．1 最适温度

5．4．2 热稳定性

5．4．3 最适pH

5．4．4 金属离子耐受性

5．4．5 酶的催化效率

5．5 本章小结

第六章 总结

参考文献

附录

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者与导师简介