基于PDMAEMA修饰的不同形貌纳米颗粒构建高性能基因载体

摘要

基因治疗是指使用功能性的治疗基因替换有缺陷或补充缺失的基因，或者通过抑制某些基因的表达来调控细胞的行为，从而达到治疗效果。在往靶细胞传递基因的过程中核酸很容易被破坏或降解，因此基因治疗的关键是需要一个有效的传递系统能够将核酸药物安全的传递到靶细胞当中。病毒可以有效地将自身的遗传信息传递到宿主细胞中，但是病毒作为载体缺乏对细胞的特异性识别、生产成本高、存在免疫原性和致突变性等安全问题。而非病毒载体稳定性好，可以长期存储，可以运载更长的基因片段，并且非病毒基因载体的物化性质可以通过不同的合成方法和化学修饰来调控，在构建基因载体时更加灵活。然而，不同于病毒载体的作用机制，非病毒载体在转染过程中需要克服细胞外和细胞内的多层屏障，例如跨越细胞膜、内涵体逃逸等过程，才能最终将所携带的核酸运载到目的地。
　　阳离子聚合物甲基丙烯酸N，N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)可以与DNA通过静电相互作用形成纳米颗粒，保护DNA免受核酸酶的降解。但较高分子量的PDMAEMA表现出良好转染性能的同时也表现出了较高的细胞毒性。另有报道称，相对于球形纳米颗粒，具有特殊形貌的纳米颗粒更易于被细胞所摄取，而细胞对纳米载体的内化效率会直接影响到最终载体的转染性能。因此，我们结合活性可控聚合，并针对在基因治疗中的关键问题和发展趋势，使用小分子量的PDMAEMA修饰不同形貌纳米颗粒，构建了一系列功能化的高效基因载体。
　　水滑石(LDH)是一种片层状的纳米颗粒，层与层之间可以通过离子交换插入阴离子药物，从而作为药物或基因载体。但是，目前基于LDH所设计的基因载体转染效率都比较低。双硫键具有还原响应性，可以细胞内还原性物质所打断，例如谷胱甘肽。由于肿瘤细胞内谷胱甘肽含量远高于细胞外环境和正常组织细胞，故在基因载体中引入双硫键可以实现载体在运输过程中保持结构稳定，而在肿瘤组织中快速瓦解，释放所携带的核酸药物。我们首先利用LDH表面的羟基在其表面引入含有双硫键的ATRP引发位点，然后使用表面引发ATRP的方法在LDH表面接枝PDMAEMA阳离子聚合物链，制备了一系列以片层状结构的LDH为基体、不同分子量PDMAEMA为聚合物侧链，并具有还原响应性的基因载体(LDH-PDs)。我们对LDH-PDs的形貌、携带DNA能力、细胞毒性、转染效率等方面进行了研究与讨论。结果表明，与线性PDMAEMA和“国际金标”PEI相比，这种基于片层状LDH的基因载体显示出了更高的细胞内化率和转染效率;在最佳氮磷比时，所制备的LDH-PDs基因载体在不同细胞中表现出的转染效率是PEI的3-9倍。
　　纳米纤维素(CNC)属于聚多糖纳米晶，具有独特的针状结构和良好的生物相容性。我们基于PDMAEMA修饰LDH制备基因载体的研究，通过对针状CNC表面修饰，在其表面通过双硫键连接PDMAEMA聚合物链，构建了一系列基于CNC的基因载体(CNC-S S-PDs)。我们对CNC-SS-PDs与DNA结合的能力、还原响应性、细胞毒性、转染效率和体外、体内抗肿瘤能力等进行了测试和表征。研究表明，CNC-SS-PDs具有高效的基因转染能力和较低的细胞毒性。同时CNC独特的针状形貌对细胞的内吞有着显著的促进作用。通过自杀基因前药系统（CD自杀基因/5-氟胞嘧啶）的体外和体内实验发现，CNC-SS-PDs能有效将CD自杀基因传递到肿瘤细胞中。在CD自杀基因表达的胞嘧啶脱氨酶的作用下，前药5-氟胞嘧啶转变成为可以杀死细胞的5-氟尿嘧啶，从而诱导肿瘤细胞的死亡，抑制肿瘤的生长。
　　基于对PDMAEMA修饰的CNC作为基因载体的研究，我们通过进一步改性，在降低载体毒性同时赋予载体成像功能。我们制备了一种可以分别引发ATRP和RAFT聚合的双功能引发剂，在CNC表面除了通过ATRP引入PDMAEMA链外，还使用RAFT聚合在CNC表面引入了聚（聚乙二醇乙醚）甲基丙烯酸酯(PEGEEMA)来降低载体毒性和提高载体的稳定性。此外，成像在临床诊疗过程中扮演着不可或缺的角色。许多研究都致力于将成像功能和基因治疗结合在一起，实现在基因治疗的同时对治疗过程的实时监测。金纳米颗粒(Au NPs)生物相容性好，比碘基的CT造影剂有更好的造影效果。我们利用PDMAEMA侧链上丰富的氨基作为固定位点将Au NPs固定在基于CNC的基因载体表面。通过测试发现，表面修饰PEGEEMA和PDMAEMA侧链的CNC载体(CNC-g-PPEG/PDMA)具有优异的转染性能，在最佳氮磷比时，转染效率可达PEI的10倍。载体表面引入Au NPs后(CNC-g-PPEG/PDMA@Au)，载体被赋予CT造影功能的同时，依然表现出与PEI相媲美的转染效率。
　　综上所述，我们使用PDMAEMA修饰了不同形貌的纳米颗粒构建了一系列高性能基因载体。所做的研究对于基因治疗过程中研发安全高效的非病毒载体具有一定的指导意义。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 基因治疗简介

1．2 基因传递系统

1．2．1 病毒载体

1．2．2 非病毒载体

1．2．3 非病毒基因载体在基因传递过程中的屏障和解决策略

1．3 活性／可控自由基聚合在生物医用材料领域的应用

1．3．1 原子转移自由基聚合(ATRP)

1．3．2 可逆加成-断裂链转移(RAFT)可控自由基聚合

1．3．3 氮氧自由基活性聚合(NMRP)

1．4 课题的目的及意义

第二章 基于PDMAEMA修饰的片层状水滑石纳米颗粒构建高性能基因载体

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 载体的制备

2．2．4 LDH-PD纳米载体的表征

2．2．5 LDH-PD／pDNA复合体的表征

2．2．6 细胞毒性测试

2．2．7 体外转染测试

2．2．8 细胞对LDH-PD／pDNA复合体内吞效率的测试

2．2．9 统计分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 载体的制备及表征

2．3．2 LDH-PD／pDNA复合体的表征

2．3．3 细胞毒性分析

2．3．4 体外转染能力分析

2．3．5 细胞内吞效率分析

2．4 小结

第三章 基于PDMAEMA修饰的针状纳米纤维素构建高性能基因载体

3．1 前言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 载体的制备

3．2．4 CNC基纳米载体的表征

3．2．5 载体／pDNA复合体的特性表征

3．2．6 细胞吞噬效率测试

3．2．7 细胞毒性测试

3．2．8 体外转染测试

3．2．9 体外抗癌细胞测试

3．2．10 动物体内抗肿瘤测试

3．2．11 统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 CNC-SS-PDs载体的制备和表征

3．3．2 CNC-SS-PDs／pDNA复合体的表征

3．3．3 细胞毒性分析

3．3．4 细胞内吞效率分析

3．3．5 体外转染能力分析

3．3．6 体外抗肿瘤细胞测试

3．3．7 体内抗肿瘤测试

3．4 小结

第四章 基于不同可控聚合方法构建纳米纤维素基多功能基因载体

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 载体的制备

4．2．4 多功能基因载体的表征

4．2．5 载体／pDNA复合体的特性表征

4．2．6 CT造影测试

4．2．7 细胞毒性测试

4．2．8 体外转染测试

4．2．9 细胞吞噬效率测试

4．2．10 统计分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 双功能引发剂的制备与表征

4．3．2 CNC表面修饰PPEGEEMA和PDMAEMA聚合物链

4．3．3 CNC-g-PPEG／PDMA表面固定Au NPs

4．3．4 体外CT造影分析

4．3．5 载体／pDNA复合体的表征

4．3．6 细胞毒性分析

4．3．7 体外转染能力分析

4．3．8 细胞内吞效率分析

4．4 小结

第五章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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