荧光材料用于HIV-1病毒基因组成像

摘要

荧光材料在生物成像领域已得到广泛应用，选择合适的荧光材料作为指示信号也就成为了研究中的重点和难点。荧光材料需要满足荧光强度高，耐漂白，毒性小，体积小等要求。目前，常用的荧光材料主要包括:有机荧光探针、荧光蛋白、和量子点。本论文围绕荧光材料应用于HIV-1病毒基因组成像展开，取得以下主要进展:
　　1)为了研究HIV-1在侵染宿主细胞早期阶段中的解离过程，我们构建了三种有侵染能力的双色荧光病毒(HIVRu-TC，HIVRu-EGFP，HIVTC-EGFP)和一种有侵染能力的三色荧光病毒（HIVRu-TC-ECFP）。结合这些多色荧光病毒颗粒和单颗粒成像技术，就可以追踪并观测到HIV-1的基质蛋白，衣壳蛋白以及基因组RNA在活细胞内的分离的全过程。在HIV-1早期侵染阶段，病毒颗粒多步解离过程首次被可视化观察到，我们采用最直观的方法解决了一个一直以来十分具有争议的问题。
　　2)为了延迟钌的有机金属配合物的光漂白问题。我们在病毒颗粒的Vpr蛋白的C端插入了六个半胱氨酸，经过病毒的组装过程，这六个半胱氨酸与病毒基因组RNA相结合，通过自身的还原性来延迟钌的配合物的光漂白。基于这一光漂白的延迟效果，对HIV-1病毒颗粒进行单色基因组RNA的荧光标记，就可以在不改造病毒衣壳CA蛋白并且不影响病毒侵染能力的情况下，对病毒的脱壳过程进行成像。
　　3)为了实现活细胞内HIV-1前病毒基因组的可视化成像，我们利用量子点(QDs)对TALE和CRISPR体系进行荧光标记，从而实现对靶向基因序列的识别和定位，同时解决单拷贝基因序列在活细胞内成像的技术难题。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 HIV-1病毒结合并进入宿主细胞

1．1．1 HIV-1病毒进入宿主细胞的基础

1．1．2 HIV-1病毒受体的发现

1．2 HIV-1病毒的脱壳过程

1．2．1 病毒的衣壳结构

1．2．2 脱壳过程发生的时间及地点

1．2．3 脱壳研究中的实验阻碍

1．3 HIV-1病毒的逆转录

1．3．1 病毒颗粒逆转录的过程

1．3．2 宿主细胞中的逆转录

1．4 HIV-1病毒的整合过程

1．4．1 整合过程的研究历史

1．4．2 宿主细胞内的整合过程

1．5 HIV-1病毒的组装、出芽和成熟

1．5．1 HIV-1病毒颗粒的组装和出芽过程

1．5．2 成熟的HIV-1病毒颗粒

1．6 HIV-1病毒的荧光标记

1．6．1 常用的荧光材料

1．6．2 荧光标记的HIV-1病毒颗粒

1．6．3 TALEN和CRISPR／Cas技术

1．7 本文研究思路与主要内容

第二章 HIV-1病毒早期侵染过程中的多步解离

2．1 实验材料和方法

2．1．1 实验材料与仪器

2．1．2 HIV-1重组质粒的构建

2．1．3 细胞培养

2．1．4 细胞转染

2．1．5 病毒颗粒的制备

2．1．6 荧光标记及病毒纯化

2．1．7 病毒p24表达量的测定(ELISA)

2．1．8 免疫荧光

2．1．9 病毒滴度的测定(TCID50)

2．1．10 病毒侵染及荧光成像

2．1．11 药物抑制实验

2．2 实验结果

2．2．1 构建有侵染能力的双色荧光病毒HIVRu-TC

2．2．2 实时成像分析HIV-1基因组从衣壳蛋白中的释放过程

2．2．3 统计分析HIV-1病毒的脱壳过程

2．2．4 实时成像和统计分析基因组与基质蛋白的分离过程

2．2．5 实时成像和统计分析衣壳蛋白与基质蛋白的分离过程

2．2．6 实时成像分析基因组，衣壳蛋白与基质蛋白的多步解离过程

2．2．7 统计分析基因组，衣壳蛋白与基质蛋白的多步解离过程

2．3 结论

第三章 荧光探针抗漂白的新方法

3．1 实验材料和方法

3．1．1 质粒

3．1．2 细胞培养

3．1．3 细胞转染

3．1．4 病毒颗粒的制备

3．1．5 荧光标记及病毒纯化

3．1．6 免疫荧光

3．1．7 病毒滴度的测定(TCID50)

3．1．8 病毒侵染及荧光成像

3．2 实验结果

3．2．1 构建耐漂白的单色荧光病毒颗粒HIVnC-Ru

3．2．2 脱壳过程中病毒抗漂白性能的消除

3．2．3 在最近真实地情况下研究HIV-1病毒的脱壳过程

3．3 结论

第四章 TALE用于HIV-1前病毒基因组成像

4．1 实验材料和方法

4．2 实验结果

4．2．1 TALE探针的设计和构建

4．2．2 TALE探针的量子点荧光标记和验证

4．2．3 活细胞内HIV-1前病毒DNA的单拷贝基因位点成像

4．3 结论

第五章 CRISPR用于HIV-1前病毒基因组

5．1 实验材料和方法

5．2 实验结果

5．2．1 CRISPR体系的设计和构建

5．2．2 CRISPR体系的量子点荧光标记和验证

5．2．3 活细胞内HIV-1前病毒DNA的单拷贝基因位点成像

5．3 结论

第六章 上转换纳米晶体传感器

4．1 实验材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 上转换荧光纳米颗粒的表面官能团修饰

4．1．3 TNT和TNP的检测

4．2 实验结果

4．2．1 上转换纳米传感器的制备和表征

4．2．2 荧光分析检测及条件探索

4．3 结论

第七章 总结

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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