硫代磷酸二乙酯类有机磷农药残留的免疫学分析研究

摘要

硫代磷酸二乙酯有机类农药是一类应用广泛，毒性较高的有机磷农药，其种类繁多，广泛应用与农业和畜牧业之中。随着近年来，有机磷农药大量使用导致的食品安全问题日益显著，对有机磷农药残留快速检测技术的开发愈显重要。目前，有机磷农药的检测的手段多为气相色谱法、高效液相色谱法和凝胶渗透色谱法等化学分析方法，这些检测方法虽然准确性较高，但也往往存在着样品处理繁复，对检测仪器和人员要求较高，检测成本较高等缺点，对于当前大批量、快速现场检测有着诸多局限性。本文所研究的酶免疫分析方法正是一种针对有机磷农药残留的简便、快速、低成本、大批量的检测方法。本次研究通过设计并合成有机磷农药化学结构设计小分子半抗原，偶联大分子蛋白制备全抗原，进行动物免疫得到抗血清，并以所得抗血清建立四种有机磷农药残留的酶免疫分析检测方法。具体工作如下:
　　1、有机磷农药半抗原的合成。参照硫代磷酸二乙酯类有机磷农药具体结构，通过添加间隔臂和活性基团，本文共设计了7个有机磷农药小分子半抗原Hapten1、Hapten2、Hapten3、Hapten4、Hapten5、Hapten6、Hapten7，通过直接合成，亲核取代及羧基保护等有机化学方法成功对其进行了合成，并进行了详细的核磁表征。
　　2、有机磷农药全抗原的制备。以合成的7个小分子半抗原及3个商业半抗原为原料，通过偶联大分子蛋白BSA制备了十个有机磷农药免疫抗原Hapten1-BSA、Hapten2-BSA、Hapten3-B SA、Hapten4-BSA、Hapten5-BSA、Hapten6-BSA、Hapten7-BSA、Hapten8-BSA、Hapten9-BSA、Hapten10-BSA，通过偶联单分子蛋白OVA制备了十个有机磷农药包被原Hapten1-OVA、Hapten2-OVA、Hapten3-OVA、Hapten4-OVA、Hapten5-OVA、Hapten6-OVA、Hapten7-OVA、Hapten8-OVA、Hapten9-OVA、Hapten10-OVA，并对所有抗原进行了详细表征。
　　3、有机磷农药免疫学分析实验。用有机磷农药免疫原注射小鼠得到相应抗血清，通过对抗血清和包被抗原进行棋盘实验，得到其最优效价组合Hapten4-OVA(1∶4000)和Sera4(1∶8000)、Hapten4-OVA(1∶8000)和Sera6(1∶16000)、Hapten4-OVA(1∶8000)和Sera4(1∶32000)、Hapten4-OVA(1∶8000)和Sera6(1∶32000)，再通过筛选后的抗血清包被抗原组合与有机磷农药标品进行间接竞争酶联免疫实验，得到抑制效果最好的四种有机磷农药对硫磷、蝇毒磷、喹硫磷和伏杀硫磷，其半抑制浓度分别达到186ppb、506ppb，1409ppb，42596ppb，均取得了较好的检测效果。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 有机磷农药简介

1．1．1 有机磷农药的理化性质概述

1．1．2 有机磷农药的毒性概述

1．1．3 硫代磷酸二乙酯类有机磷农药

1．2 有机磷农药残留检测技术简介

1．2．1 有机磷农药残留的检测前处理

1．2．2 光度法

1．2．3 薄层色谱法

1．2．4 气相色谱法

1．2．5 高效液相色谱法

1．2．6 酶抑制法

1．2．7 毛细管电泳法

1．2．8 酶免疫分析法

1．3 酶免疫分析技术简介

1．3．1 酶免疫分析技术的基本原理

1．3．2 酶免疫分析方法的种类

1．3．3 酶免疫分析方法在有机磷农药残留检测中的应用

1．4 文章立意

第二章 有机磷农药半抗原的合成

2．1 引言

2．2 实验仪器与实验材料

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验材料

2．3 有机磷农药半抗原合成实验步骤

2．3．1 有机磷农药半抗原Hapten 1的合成

2．3．2 有机磷农药半抗原Hapten 2的合成

2．3．3 有机磷农药小分子半抗原Hapten 3的合成

2．3．4 有机磷农药小分子半抗原Hapten 4的合成

2．3．5 有机磷农药小分子半抗原Hapten 5的合成

2．3．6 有机磷农药小分子半抗原Hapten 6的合成

2．3．7 有机磷农药小分子半抗原Hapten 7的合成

2．4 有机磷农药半抗原的表征

2．4．1 有机磷农药小分子半抗原Hapten 1的表征

2．4．2 有机磷农药小分子半抗原Hapten 2的表征

2．4．3 有机磷农药小分子半抗原Hapten 3的表征

2．4．4 有机磷农药小分子半抗原Hapten 4的表征

2．4．5 有机磷农药小分子半抗原Hapten 5的表征

2．4．6 有机磷农药小分子半抗原Hapten 6的表征

2．4．7 有机磷农药小分子半抗原Hapten 7的表征

2．5 结果与讨论

第三章 有机磷农药全抗原的制备

3．1 引言

3．2 实验仪器与实验材料

3．2．1 实验仪器

3．3．1 有机磷农药免疫抗原的制备

3．3．2 制备有机磷农药包被抗原

3．3．3 有机磷农药全抗原的纯化

3．4．1 SDS-凝胶电泳进行纯度表征

3．4．2 紫外扫描光谱法进行表征

3．4．3 红外扫描光谱法进行结构表征

3．4．4 生物质谱法进行结构表征

3．5 结果与讨论

4．1 引言

4．2 实验仪器与实验材料

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验材料

4．3 有机磷农药免疫学分析的实验过程

4．3．1 动物免疫实验过程

4．3．2 抗血清包被抗原亲和性评定实验过程

4．3．3 有机磷农药残留抑制实验

4．4 结果与讨论

第五章 总结与展望

参考文献

研究成果及发表的学术论文