BMSC/纤维膜复合细胞层进行骨软骨再生修复研究

摘要

骨关节炎、软骨磨损和骨软骨组织缺损是临床中常见的问题，骨软骨组织工程是一种治疗骨软骨缺损最具潜力的手段，制备能保持种子细胞的增殖、分化活性，且与体内微环境匹配的仿生支架对骨软骨组织工程至关重要。骨软骨结构复杂，构建仿生梯度支架有难度，而且现有种子细胞复合支架的组织工程策略，获取种子细胞时可能造成对细胞黏附分子和细胞间连接信号的破坏，接种时可能会发生种子细胞的流失。采用细胞层技术可避免上述问题，获得的具有完整细胞外基质细胞层，可极大程度地保存细胞活性，通过多层叠加构建三维组织修复体，用于骨软骨组织再生研究具有优势。
　　为赋予细胞层良好的操作性和调控性，本研究以静电纺丝法制备的纤维膜为支撑，孵育骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞层，BMSCs是具有多向分化潜能的成体干细胞，纤维膜仿生天然细胞外基质的结构，为BMSCs的增殖和分化创造有利微环境。针对骨软骨再生修复，本论文重点探索了BMSCs细胞层在体外的成软骨、成钙化软骨和成骨分化调控，并仿生构建了三维梯度骨软骨修复体植入新西兰白兔膝关节骨软骨缺损，评价了梯度诱导分化的BMSCs细胞层/纤维膜复合体用于骨软骨再生修复的可行性。
　　首先，制备了无纺聚乳酸/明胶复合纤维膜，在其上接种BMSCs并孵育得到结合紧密的细胞层/纤维膜复合膜片结构。采用不同比例的成骨诱导分化液和成软骨诱导分化液混合，研究了细胞层/纤维膜复合物的体外成骨、成软骨的分化性能，并探究了成钙化软骨的最佳体外诱导条件。结果表明，相对于细胞培养板，纤维膜对细胞粘附、增殖有明显的促进效应，提高了细胞层的成骨和成软骨分化能力，并确定在50％成骨诱导分化液与50％成软骨诱导分化液共同作用下，细胞层表现出显著的成钙化软骨特性。
　　其次，将经过不同诱导条件诱导分化后的细胞层/纤维膜复合物按成软骨-成钙化软骨-成骨顺序进行堆叠，得到仿骨软骨生理结构的三维梯度修复体，并将其置于新西兰白兔膝关节的骨软骨缺损区域，在术后6周、12周和24周通过Micro-CT、组织学染色和免疫组织化学染色，分析骨软骨缺损的修复再生效果。结果表明，三维梯度细胞层/纤维膜复合物的植入加速了骨基质的钙化，明显增强了兔膝关节骨软骨缺损的再生修复能力;与未进行梯度诱导分化的细胞层/纤维膜植入体比较，成骨区与成软骨区中间引入的钙化软骨层，可以有效地隔绝双相的接触与相互侵入，更好地保持了软骨与骨的微观生长环境，更有利于完整软骨层的形成。
　　综上所述，以纤维膜为基板构建的BMSCs细胞层，在体外与体内均表现出良好的促细胞增殖和分化的能力，经体外梯度诱导分化的细胞层，通过仿生骨软骨结构构建的三维梯度修复体，可以促进骨软骨缺损的再生修复，细胞层/纤维膜复合物有望作为一种新型的生物材料，在骨软骨组织工程领域获得应用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 骨软骨组织工程

1．1．1 骨软骨组织工程

1．1．2 骨软骨组织结构

1．1．3 骨软骨修复方法

1．1．4 骨软骨支架材料

1．1．5 常用的骨软骨种子细胞

1．2 细胞层技术

1．2．1 细胞层的制备

1．2．2 细胞层的应用

1．3 本课题的提出和意义

第二章 rBMSCs细胞层／纤维膜复合物的构建及梯度诱导分化

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验原料

2．2．2 实验仪器与设备

2．2．3 实验方法

2．2．4 PLLA／Gel复合纤维膜的制备

2．2．5 大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的提取及维系

2．2．6 PLLA／Gel复合纤维膜的细胞毒性评价

2．2．7 单层细胞层／纤维膜复合物的制备与表征

2．2．8 细胞层／纤维膜复合物的成骨、软骨诱导及钙化软骨区诱导条件的探索

2．2．9 统计学分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 PLLA／Gel纤维膜的表征

2．3．2 rBMSCs在PLLA／Gel复合纤维膜上的生长

2．3．3 细胞层／纤维膜复合物的表征

2．3．4 细胞层／纤维膜复合物的诱导分化表征

2．4 小结

第三章 细胞层／纤维膜复合物的骨软骨修复性能的研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验原料

3．2．2 实验仪器与设备

3．2．3 实验方法

3．2．4 PLLA／Gel复合纤维膜对兔BMSCs的影响

3．2．5 兔BMSCs细胞层／纤维膜复合物的制备与表征

3．2．6 兔BMSCs细胞层／纤维膜复合物成骨软骨分化性能的研究

3．2．7 体内骨软骨缺损修复

3．2．8 统计学分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 兔BMSCs在PLLA／Gel复合纤维膜上的生长

3．3．2 细胞层／纤维膜复合物的表征

3．3．3 兔BMSCs细胞层／纤维膜复合物成骨软骨分化性能

3．3．4 复合纤维膜对rBMSCs与兔BMSCs影响的简单对比

3．3．5 细胞层／纤维膜复合物修复骨软骨缺损能力的表征

3．3．6 新西兰白兔骨软骨缺损缺损模型的构建

3．3．7 术后大体观察

3．3．8 Micro-CT结果

3．3．9 组织学检测结果

3．3．10 免疫组织化学检测结果

3．3．11 体内结果分析

3．4 小结

第四章 结论

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

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