改造木糖非磷酸化代谢途径及莽草酸途径生物合成高附加值产物

摘要

随着石油资源的紧缺和环境的不断恶化，利用可再生资源构建微生物细胞工厂生产化学品、燃料和药品成为了研究重点。近年来，随着代谢工程与合成生物学的发展，实现了多种天然产物的生物合成。但是，由于缺乏已知的代谢途径或相关酶，且很多非天然产物没有相关的代谢途径，导致许多高附加值产物无法实现生物合成。为了解决这一问题，本研究利用酶的混杂性或改造已有酶的催化性质，从而拓宽酶的底物谱并构建人工代谢通路，实现了6种高附加值化合物的生物合成。
　　木糖作为木质纤维素中的第二大糖，在微生物中的代谢效率却远远低于葡萄糖。为了提高大肠杆菌的木糖利用效率，我们研究了木糖非磷酸化代谢途径中不同来源的相关酶，优化了木糖非磷酸化途径在大肠杆菌中的表达。并以此为基础，利用酶的混杂性，筛选途径中的关键酶，成功在大肠杆菌中鉴定了新的3，4-二羟基丁醛脱氢酶，从而构建了一条全新的3，4-二羟基丁酸生物合成途径，通过优化代谢网络，3，4-二羟基丁酸的摇瓶产量达到1.27g/L，是目前已报导的最高产量。接着，我们利用蛋白质工程方法，理性设计并改造丙二醇脱水酶，通过解除底物抑制、增大催化口袋和优化金属离子催化距离将一个天然不催化1，2，4-丁三醇的酶改造为可利用1，2，4-丁三醇生产1，4-丁二醇的酶。在此基础上，优化了由木糖合成1，2，4-丁三醇的途径并与改造后的丙二醇脱水酶偶联实现了1，4-丁二醇从头合成代谢新途径的构建，摇瓶产量达到209mg/L。由于目前木糖生产1，4-丁二醇过程中最主要的副产物是1，2，4-丁三醇，因此，本研究不仅成功得到了一个天然不存在的新酶，同时还实现了副产物向目标产品的二次转化。在上述研究基础上，我们评估了木糖三种代谢途径的碳利用率，首次发现了，木糖的磷酸化途径和非磷酸化途径在生产TCA循环衍生物过程中存在协同效应。以木糖生产戊二酸为例，当两条途径协同生产时，戊二酸的产量为602mg/L，高于单独使用任意一条途径时的产量(104或209mg/L)，甚至高于单独利用葡萄糖生产戊二酸的产量(420mg/L)。本研究不仅实现了利用酶的混杂性和蛋白质工程策略生产没有代谢途径的非天然产物，还展示了一种木糖高效利用的新策略。
　　另外，我们还利用酶的混杂性首次实现了三种未知天然合成途径的重要酚类化合物（焦性没食子酸、水杨醇和龙胆醇）的生物全合成。酚类化合物是一类芳香族化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、防紫外和防腐等生物活性，在医药工业上具有十分重要的价值。然而，这类化合物在自然界中的含量非常低，因此限制了它们的大规模商业化应用。本研究首次探索并扩展了存在于斯氏假单胞菌中的苯酚羟化酶PH的底物谱并揭示了该菌中的小蛋白PHQ可以增强PH的催化活性;在此基础上，我们将儿茶酚的生物合成途径与PH催化的羟基化反应相偶联，构建了一条全新的焦性没食子酸生产途径，摇瓶产量达到76.7mg/L。接着，我们根据底物和产物的结构类似性，利用生物勘探法和酶的混杂性，在一系列加氧酶和羟化酶中鉴定和表征了一种十分高效的2，3-二羟基苯甲酸单加氧酶，首次实现了2，3-二羟基苯甲酸向焦性没食子酸的转化，并构建了一条基于水杨酸单加氧酶的焦性没食子酸的生物合成新途径。通过增加莽草酸途径碳代谢流、模块优化合成途径和缓解产物的自氧化等策略进行优化，焦性没食子酸的摇瓶产量达到1.04g/L。为了解决酚醇类物质的生物合成问题，我们通过研究水杨酸-5-羟基化酶和羧酸还原酶CAR的混杂性和底物谱，首次实现了由水杨酸合成龙胆酸并由水杨酸和龙胆酸分别合成水杨醇和龙胆醇。再在此基础上构建并优化了水杨醇和龙胆醇的从头合成途径，最终水杨醇和龙胆醇的摇瓶产量分别达到594.4mg/L和30.1mg/L。本研究工作不仅实现了几种酚类化合物的首次生物全合成，还展示了如何利用酶的混杂性构建非天然生物合成途径生产高附加值产物。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 木糖磷酸化代谢方式及利用现状的研究进展

1．3 构建木糖非磷酸化代谢平台生产高附加值产物

1．3．2 木糖的非磷酸化代谢途径的研究进展

1．3．3 3-羟基-γ-丁内酯和3，4-二羟基丁酸的商业价值及生产现状

1．3．4 1，4-丁二醇的商业价值及生产现状

1．3．5 戊二酸的商业价值及生产现状

1．4 改造大肠杆菌莽草酸途径生产高附加值酚类化合物

1．4．1 大肠杆菌莽草酸途径

1．4．2 焦性没食子酸的商业价值和生产现状

1．4．3 水杨醇和龙胆醇的商业价值和生产现状

1．5 本论文的立题目的及研究意义

1．6 本论文的研究内容与方法

第二章 改造木糖非磷酸化代谢途径生物合成3，4-二羟基丁酸

2．1 引言

2．2 实验材料和实验方法

2．2．2 质粒构建

2．2．3 蛋白质表达与纯化

2．2．4 体外酶活测试

2．2．5 大肠杆菌发酵生产3，4-DHBA

2．2．6 代谢物分析

2．3 结果分析

2．3．1 设计3，4-DHBA的人造生物合成途径

2．3．2 研究及表征新途径中涉及的酶

2．3．3 利用木糖从头合成3，4-DHBA

2．3．4 筛选和鉴定高效的3，4-二羟基丁醛脱氢酶以实现3，4-DHBA高产

2．3．5 敲除竞争性途径以优化3，4-DHBA的生产

2．4 讨论

第三章 理性改造二醇脱水酶实现1，4-丁二醇的生物合成

3．1 引言

3．2 实验材料和实验方法

3．2．1 化学品和试剂

3．2．2 菌种和质粒

3．2．3 质粒构建

3．2．4 培养基

3．2．5 全细胞生物催化

3．2．6 体外耦合酶活测试

3．2．8 代谢物分析

3．2．9 计算机分析和模拟

3．3 结果分析

3．3．1 检测原始二醇脱水酶对于1，2，4-BTO的活性

3．3．2 提高酶对于底物抑制的相容性

3．3．3 提高酶对于底物分子大小的相容性

3．3．4 优化01-M离子距离提高酶对于1，2，4-BTO的活性

3．3．5 以木糖为底物从头合成1，4-BDO

3．4 讨论

第四章 探索木糖代谢途径间协同效应对合成戊二酸的影响

4．1 引言

4．2 实验材料和实验方法

4．2．1 培养基、菌株和质粒

4．2．2 质粒构建

4．2．3 大肠杆菌从头合成戊二酸

4．3．1 探究不同木糖代谢途径生产戊二酸的能力

4．3．2 探究不同木糖代谢途径之间的协同效应

4．3．3 优化不同木糖代谢途径之间的协同效应

4．4 讨论

第五章 基于苯酚羟基化酶的焦性没食子酸的生物合成

5．1 引言

5．2 实验材料和实验方法

5．2．1 培养基、菌株和质粒

5．2．2 质粒构建

5．2．3 体外粗酶活测定

5．2．4 饲喂实验

5．2．5 从头合成焦性没食子酸

5．2．6 代谢物分析

5．3 结果分析

5．3．1 探究PHQ在PH催化过程的作用

5．3．2 探究PH的底物谱

5．3．3 利用PH的混杂性构建全新的焦性没食子酸生物合成途径

5．4 讨论

第六章 基于水杨酸单加氧酶的焦性没食子酸的生物合成

6．1 引言

6．2 实验材料和实验方法

6．2．1 培养基、菌株和质粒

6．2．2 质粒构建

6．2．4 体外纯化酶活测定NahG的酶学常数

6．2．5 饲喂实验

6．2．6 从头合成焦性没食子酸

6．2．7 代谢物分析

6．3 结果分析

6．3．1 设计一条全新的合成焦性没食子酸的生物途径

6．3．2 鉴定和表征高效的2，3-DHBA-1-单加氧酶

6．3．3 增强途径碳代谢流以高效生产焦性没食子酸

6．3．4 通过模块优化来提高产量

6．3．5 缓解焦性没食子酸的自氧化来提高产量

6．4 讨论

第七章 代谢工程大肠杆菌生物合成水杨醇和龙胆醇

7．1 引言

7．2 实验材料和实验方法

7．2．1 培养基、菌株和质粒

7．2．2 化学合成龙胆醇

7．2．3 质粒构建

7．2．4 饲喂实验

7．2．5 从头合成水杨醇和龙胆醇及代谢物分析

7．3 结果分析

7．3．1 由水杨酸和龙胆酸合成水杨醇和龙胆醇

7．3．2 由水杨酸合成龙胆酸和龙胆醇

7．3．3 构建从头合成水杨醇和龙胆醇的途径

7．4 讨论

第八章 结论与展望

8．1 本研究的主要结论及展望

8．2 创新点

附录

参考文献

致谢

研究成果及发表的论文

作者及导师简介